Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

ультате ослабления гидрофобных взаимодействий и разрушения водородных и дисульфидных связей полипептидные цепи принимают конформацию статистически беспорядочного клубка. р-Меркаптоэтанол при этом используется для восстановления внутри- и межцепочечных дисульфидных мостиков, способствуя дезагрегации белков. Связывание детергента с полипептидами сообщает им большой отрицательный заряд. В результате этого белки перемещаются при электрофорезе к аноду со скоростью, зависящей от их молекулярной массы.

Зависимость между значением молекулярной массы и степенью электрофоретической подвижности белка выражают графически. При работе с акриламидом необходимо соблюдать осторожность, поскольку он является ядом, который не выводится из организма.

Оборудование: 1. Центрифуга типа УЦП-60. 2. Термостат на 37 °С. 3. Мешалка магнитная. 4. Эксикатор с краном (вакуумный). 5. Посуда и реактивы, необходимые для приготовления белковых образцов для электрофореза. 6. Прибор для электрофореза на пластинах геля. 7. Химическая посуда, необходимая для исследований методом электрофореза.

Материалы и химреактивы: 1. Фракция ПМ. 2. 0,6 М КС1. 3. 80 мМ трис-малеат в 0,25 М сахарозе. 4. NaCl, SDS. 5. р-меркаптоэтанол. 6. Сахароза. 7. Трис. 8. Глицин. 9. ЭДТА. 10. Белковый препарат (лабораторная работа №31). 11. Акриламид. 12. Бисакриламид. 13. 10%-й персульфат аммония. 14. 10 %-й тетраметилэтилендиамин (ТЭМЭД). 15. Трис-глициновый буфер. 16. Бромфеноловый синий. 17. 12 %-я ТХУ. 18. 20 %-я сульфосалициловая кислота. 19. Этанол. 20. Уксусная кислота. 21. Кумасси синий.

Лабораторная работа № 31.

Проведение солюбилизации и получение белковой фракции плазматических мембран неисчерченных мышц

Ход работы. Фракцию плазматических мембран получают из клеток неисчерченных мышц кролика (см. 3.10). Белки солюбилизируют раствором высокой ионной силы. Для этого фракцию ПМ экстрагируют 0,6 М КО, 80 мМ трис-малеатом в растворе 0,25 М сахарозы (рН = 7,2) в течение 1 ч при 2 °С.

После этого пробы центрифугируют при 105 000 g в течение 1 ч, затем ресуспендируют 0,25 М сахарозой и снова центрифугируют при 105 000 g. Полученный осадок гомогенизируют в 1 мл следующей среды: на 3 мг мембранного белка 10 мМ SDS, 8 мМ NaCl, 2,5 мМ трис-малеата, 0,5 мМ Р-меркаптоэтанола (рН=7,4). Затем полученный раствор диализируют при 2 °С в течение 36 ч против раствора А следующего состава: 8 мМ NaCl; 2,5 мМ трис-малеата, 0,5 мМ р-меркаптоэтанола (рН = 7,4). Во время диализа из диализата удаляется 97—98 % детергента. Для того чтобы из диализата удалить осаждаемый материал, его центрифугируют 30 мин при 48 000 g. Супернатант будет содержать около 95 % всех мембранных белков, концентрацию которых определяют по методу Лоури (см. 3.10). Супернатант берут для фракционирования белков методом электрофореза. Электрофорез проводят на пластинках (7ХЮ см) 5 % ПААГ при рН=7,2.

Приготовление образца. Белковый препарат смешивают с 2 М сахарозой так, чтобы конечная концентрация белка была 1 мг/мл. Отвешивают на весах по 0,5 мг белков-стандартов и растворяют каждую порцию в 0,5 мл диссоциирующего раствора, представляющего 1 % SDS в трис-глициновом (электродном) буфере (рН=8,0).

Для приготовления трис-глицинового буфера (рН=8,0) берут 6,0 г триса и 28,8 г глицина, растворяют их в воде и доводят объем до 1 л дистиллированной водой. (Концентрации веществ в буфере следующие 5 мМ триса, 5 мМ глицина, 0,5 мМ ЭДТА, рН=8,0).

Белки инкубируют в этом растворе в течение 1 ч при 37 °С. Затем в каждый образец добавляют 0,1 мл 5 %-го р-меркаптоэтанола до концентрации 1 % в общем объеме и немедленно помещают пробы в термостат. Инкубацию в присутствии В-меркаптоэнтанола в бескислородной среде осуществляют 1 час при 37 ° С. В результате белки подвергаются полной диссоциации.

Лабораторная работа № 32.

Разделение белковой фракции плазматических мембран неисчерченных мышц кролика методом электрофореза на пластинах 5 % ПААГ

Ход работы. Приготовление геля. Электрофорез проводят на 5 % ПААГ, который готовят следующим образом. Берут 12,0 мл раствора, содержащего 8 % акриламида и 0,2 % бисакриламида. Чтобы вызвать полимеризацию в этом растворе добавляют 0,12 мл 10 %-го персульфата аммония и 0,12 мл 10 %-го ТЭМЭД. Концентрация SDS в геле — 0,1 %. Затем смесь быстро наносят на пластинки. Прежде чем произойдет полимеризация, на акриламид осторожно наслаивают небольшой объем трис-глицинового (электродного) буфера. Гель готов к использованию через 2 ч.

Проведение электрофореза. По завершении инкубации в белковый раствор добавляют 3—4 капли глицерина или этиленгликоля и 3—4 капли 2 %-го раствора красителя' бромфенолового синего. Общий объем смеси не должен превышать 1 мл. Смесь тщательно перемешивают и 0,1 мл ее микропипеткой наносят на пластинку. Во вноРис. 94. Калибровочная кривая для определения молекулярной массы диссоциированных белков:

М — молекулярная масса белка; X — длина пробега индивидуального белка; 1 — альбумин бычий; 2 — каталаза; 3 — альбумин яичный; 4 — оксндаза D-аминокислот: 5 — трипсин; 6 — цитохром с

симом объеме должно содержаться не менее 50 мкг белка. Сверху осторожно наслаивают электродный буфер, содержащий 0,1 % SDS. Необходимо избегать сильного охлаждения электродных сосудов, так как SDS может выпасть в осадок, поэтому электрофорез надо проводить при комнатной температуре.

После окончания электрофореза гель фиксируют в течение ночи в 12 %-й ТХУ или 20%-й сульфосалициловой кислоте.

Белки выявляют, поместив гели в 0,05 %-й раствор кумасси синего в смеси этанол — уксусная кислота — вода (10: 1 :30). Этой же смесью производят отмывку избытка краски. Затем измеряют длину пробега каждого белка от линии старта с точностью до 0,1 мм. Эти данные сравнивают с калибровочной кривой (рис. 94), которая строится по данным, полученным на белках-стандартах (табл. 8).

Как видно из рис. 94, существует линейная зависимость подвижности белков в 5 %-м ПААГ от величины их молекулярных масс. Это дает возможность сравнивать мембранные

страница 90
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2019)