Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

белки с белками-стандартами.

8. Исходные данные длн построения калибровочной кривой прн определении молекулярной массы диссоциированных белков

Название белков-маркеров Величины молекулярных масс белков в присутствии SDS IgM Длина пробега белка в геле (мм), т.е. величины х (среднее значение)

Сывороточный альбумин

быка 66 000 4,82 24,60 1,39

Каталаза 60000 4,78 25,50 1,41

Яичный альбумин 43 000 4,63 28,00 1,45

Оксндаза D-аминокислот 37 000 4,57 31,00 1,49

Трипсин 23 700 4,37 36,00 1,56

Цитохром с 12 000 4,08 43,00 1,63

Примечание. Данные таблицы получены при работе с 5 %-м ПААГ и длиие пробега индикаторной краски в нем, равной 45 мм. . Контрольные вопросы и задания

1. Каковы общие свойства мембранных белков? 2. Какие вы знаете типы мембранных белков, исходя из их функций? 3. Как определить расположение белка в мембране? 4. Какими методами исследуются мембранные белки? 5. Изложите теоретические основы методов электрофореза.

3.15. ИЗУЧЕНИЕ Mg2+, Са2+ — АТФ-АЗНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН

В изучении процессов создания и поддержания ионных градиентов в клетках наибольший интерес представляет активный транспорт ионов против градиента концентрации.

Создание и поддержание посредством активного транспорта ионных градиентов в клетках сопровождается увеличением свободной энергии, что обусловливает сопряжение активного транспорта ионов с самопроизвольной экзерго-нической реакцией. Например, хорошо изученный активный транспорт ионов Na+ и К+ непосредственно сопряжен с реакцией гидролиза АТФ Mg2+-3aBHCHMoft, Na+, ^-активируемой АТФ-азой плазматической мембраны (ПМ). В 1966 г. А. Вебер высказала предположение, что в мышечной клетке помимо Са2+-транспортирующих систем митохондрий и саркоплазматического ретикулума существует третья энергозависимая система, которая локализована в ПМ и участвует, как и первые две, в регуляции внутриклеточной концентрации кальция.

В последующие годы предположение об энёргозависи-мом выходе кальция из мышечных клеток было экспериментально подтверждено отечественными и зарубежными исследователями. В некоторых мышечных клетках существуют даже специальные образования, регулирующие внутриклеточную концентрацию кальция. К таким образованиям относится, например, система впячиваний ПМ — система клефтов в мышцах-депрессорах морского желудя. Более того, прямая связь между мембраной клефта и пузырьками саркоплазматического ретикулума может свидетельствовать о том, что эти контакты функционально могут заменить неразвитую в данном типе мышц Т-систему. Это еще раз подчеркивает вездесущность мембранных структур и универсальность их в выполнении функций.

В неисчерченной мышце в связи со сравнительно слабо развитым саркоплазматическим ретикулумом плазматической мембране, по-видимому, принадлежит главная роль в поддержайии гомеостаза внутриклеточного кальция. При сравнительно небольшой концентрации ионов кальция внутри и снаружи неисчерченной мышечной клетки они в зиачительной степени определяют величину мембранного потенциала покоя и сопротивления мембраны к электрическому току. Последнее свидетельствует об изменении полной проводимости ПМ в ответ на изменение внеклеточной концентрации кальция. Сократительная активность мышечной клетки тесным образом связана с возникновением электрической активности. Ионы кальция диффундируют внутрь неисчерченной мышечной клетки и, являясь переносчиками электрических зарядов во время возбуждения, активируют ее структурные сократительные элементы. Для последующего расслабления концентрацию ионов кальция в саркоплазме необходимо уменьшить до Ю-7 М, что и выполняет Са-насос ПМ, структурно-функциональной основой которого является АТФ-аза, активируемая кальцием. Транспорт кальция во внеклеточную среду рассматривается как один из механизмов расслабления мышечных клеток.

Оборудование: установка для потенциометрического определения АТФ-азной активности ПМ; набор химической посуды.

Материалы и химреактивы; 1. фракция ПМ неисчерченных мышечных клеток. 2. NaCl, КС1, АТФ, MgCl2, СаС12, имидазол. 3. Липосомы из азолектина. 4. Оуабаин и окси-тоцин.

Лабораторная работа № 33.

Исследование зависимости Mg2+, Са2+ —

АТФ-азной активности ПМ от концентрации Са2+, рН и t°

Ход работы. АТФ-азную активность измеряют потенцио-метрически (рис. 95) по закислению слабо буферной среды инкубации при реакции гидролиза АТФ. Закисление среды обусловлено накопление протонов, появляющихся при диссоциации ионов фосфата.

АТФ4-—^ АДФ3- + Н2РО-

(Н2РО7 —> Н+ + НРО2-)

Установка состоит из рН-метра ЛПУ-01, самопишущего потенциометра КСП-4 со шкалой 10 мВ и термостатируе-мой водяной бани. Чувствительность установки — 0,08— 0,1 ед. рН на всю шкалу потенциометра. Этот метод определения АТФ-азной активности обладает рядом преиму-

Рис. 95. Схема установки у-_ _ _

для потенциометрического определения АТФ-фазной активности

Датчик ЛПУ-01 Самописец

¦ рН ксп-и ¦ ществ перед методом Фиске — Суббароу (см. 3.10). Ои является более точным, позволяет вести ферментативную реакцию в условиях жесткого контроля рН и температуры и дает возможность определять начальную скорость реакции гидролиза АТФ.

Реакция гидролиза АТФ проводится при 37 °С в тефло-новой ячейке объемом 4 мл в среде инкубации следующего состава (в мМ): NaCl — 100, КО — 20, АТФ — 3, MgCl2 — 5, имидазол-НО — 5. Реакцию запускают внесением в ячейку 20—30 мкг мембранного белка и определяют общую Mg24"! Na+, К+ — АТФ-азную активность. Величину Na+, К+ — АТФ-азной активности фиксируют по уровню ингибирования общей АТФ-азной активности оуабаином (100мкМ). Mg2+, Са2+ — АТФ-азную активность определяют по приросту общей активности (лучше в присутствии оуабаина) при внесении в среду инкубации соответствующей концентрации кальция: 5, 10, 15, 20 мкМ и 1, 2, 3, 4 мМ. По полученным значениям строят график зависимости прироста активности от lg[Ca2+]. При

страница 91
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)