Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

корректной постановке опыта получается зависимость, пример которой приводится на рис. 96.

Определив максимум Mg2+, Са2+ — АТФ-азной активно-сти в области микромолярных концентраций кальция, исследуют зависимость указанной активности от рН и температуры, учитывая, что предыдущие эксперименты проведены при 37 °С и рН=7,2. По окончании опытов, исходя из уравнения Михаэлиса — Ментен

_ Уша[С]

рассчитывают методом Лайнуивера — Берка константу Михаэлиса для Са2+ при максимальной активности. Строят

7 6 5 4 -(gfCaClJ

Рис. 96. Зависимость АТФ-азиой активности фракции ПМ от концентрации СаС12.

Среда инкубации содержит: 1,25 мМ имида-зол HC1 (рН=7 2), 100 мМ NaCl, 20 мМ KC1, 8 мМ MgClj. ЗмМ АТФ

Рис. 97. График Лайнуивера — Берка

1/V

^ 'так

1/С график зависимости 1/Ь от 1/С. В уравнении Михаэлиса — Меитен v и иШах — скорость и максимальная скорость гидролиза АТФ, Km — константа Михаэлиса, а [С] — концентрация вещества, от которого зависит скорость реакции.

Графическое выражение метода Лайнуивера — Берка представлено на рис. 97.

Лабораторная работа М 34. Исследование активирующего действия азолектина и ингибирующего — окситоцина на Mg2+, Са2+ — АТФ-азную активность плазматических мембран

Ход работы. Понимание того, насколько экзогенные липиды влияют на функционирование энзиматических комплексов плазматической мембраны, важно как для решения задач в плане реконструкции, так и для практических при* ложений (мембранная инженерия, взаимодействие мембран, липосомная терапия).

Важным в исследованиях индивидуальных энзимов мембран является наличие ингибиторов. Для одной из важных транспортных АТФ-аз — Na+, К+ — АТФ-азы — специфическим ингибитором является оуабаин. Для Mg2+, Са2+ — АТФ-азы ПМ долгое время не удавалось установить специфического ингибитора. В последнее время для Mg2+, Са2+— АТФ-аз были открыты ингибиторы. Для аналогичной активности ПМ неисчерченных мышечных клеток тонких кишок кролика нами определен как ингибитор гипота-ламо-гипофизарный гормон окситоции.

Мембранно-связанные ферменты, как уже указывалось, проявляют свою активность только в липидном окружении. Причем разные липиды и другие физиологически активные вещества по-разному влияют на активность ферментов. Как видно из рис. 98, на котором

Рис. 98. Зависимость АТФ-азной активности сарколеммы неисчерченных мышечных клеток от наличия в пробах экзогенных липидов:

/ — ультразвуковые диспергаты азолектина; 2 — фосфатидилхолии; 3 — дипаль-тоилфосфатадилхолин; 4 — фосфолипиды мозга. Среда инкубации содержит 2 мМ имидазол-HCl (рН=7,2), 100 мМ NaCl, 20 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 3 мМ АТФ. представлены полученные нами зависимости общей АТФ-азной активности ПМ неисчерченных мышечных клеток тонких кишок кролика, активность увеличивают азолектин (суммарная фракция фосфолипидов из бобов сои) и фосфатидилхолин. В то же время общие фосфолипиды мозга быка (во фракции присутствует холестерин), дипальми-тоилфосфатидилхолин и холестерин угнетают АТФ-азную активность.

Определив оптимальную микромолярную концентрацию ионов кальция, исследуют влияние азолектина на величину Mg2+, Са2+ — АТФ-азной активности ПМ. Для этого все операции проводят, как и в лабораторной работе № 33. Но реакцию запускают не чистой фракцией ПМ, а фракцией, проинкубированной с азолектиновыми липосомами. (Приготовление липосом см. в 3.20.) Для инкубирования везикул ПМ с азолектиновыми липосомами липид берут в концентрации 100, 300, 500 мкг/мл или 200, 400, 600 мкг/мл. АТФ-азную активность определяют потеициометрически, на основании полученных данных строят график, аналогичный графикам на рис. 96.

Таким же способом определяют и зависимость Mg2+, Са2+ — АТФ-азной активности от концентрации окситоцина. Окситоции прибавляют в инкубационную смесь начиная с концентрации Ю-10 ME (ME — международная единица активности окситоцина) с последующим увеличением на порядок. Эксперимент прекращают при постоянном изменении величины Mg2+, Са2+ — АТФ-азной активности. Как и в предыдущем определении, строят график зависимости активности Mg2+, Са2+ — АТФ-азной активности ПМ от концентрации окситоцина. Используя положения ферментативной кинетики Михаэлиса — Ментен, определяют константу ингибирования (Кг). Одним из способов определения Ki является метод Лайнуивера — Берка (см. лабораторную работу № 33).

Контрольные вопросы и задания

1. Какова предполагаемая функция Mg2+, Са2+— АТФ-азной активности ПМ неисчерченных мышечных клеток? 2. Каков механизм ингибирования Na+, К+ — АТФ-азы оуа банном? Можно ли предположить аналогичный механизм ингибирования окситоцином Mg2+, Са2+ — АТФ-азной активности? 3. Как влияют липиды на энзиматическую активность ПМ клеток? 4. Расскажите о конкурентном и неконкурентном ингибировании ферментативной активности. 5. Назовите механизмы трансмембранного движения кальция в неисчерченных мышечных клетках. 6. Расскажите о принципе потенциометрического метода исследования реакции гидролиза АТФ. 3.16. ИЗУЧЕНИЕ ИОННОГО ТРАНСПОРТА В ГЕПТАНОВЫХ МЕМБРАНАХ

В физико-химическом анализе мембранных явлений существенную роль играют электрохимические потенциалы подвижных ионов (р). Электрохимический потенциал — это работа по перемещению одного моля заряженных частиц из стандартного состояния в данное. В том случае, если электрические потенциалы системы в стандартном состоянии и в данном одинаковы, мы получим просто химический потенциал, который является функцией концентрации растворенного вещества. Именно разница химических потенциалов является движущей силой диффузии неэлектролитов из области большего в область меньшего потенциала. Если же электрические потенциалы отличаются, то кроме работы химических сил совершается работа электрических сил, и в этом случае суммарная работа состоит из двух слагаемых — химической и электрической. Эта суммарная работа и равна электрохимическому потенциалу

^ = ,j°-f ДТ In а± + nFгде р° — стандартное значение химического потенциала; R — универс

страница 92
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)