Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

и (скальпели, ножницы, пинцеты).

Материалы и химреактивы: свежевыделенный мозг крупного рогатого скота, хлороформ, этанол, а-токофе-рол, смесь, содержащая ванилин (10 мМ) и ортофосфат (11,5 мМ), эталонный раствор липидов, концентрированная серная кислота, жидкий азот, дистиллированная вода.

Лабораторная работа № 36. Выделение общей фракции липидов из мозга крупного рогатого скота

Ход работы. Мозговую ткань обильно промывают холодной дистиллированной водой для удаления остатков крови. Для опыта ножницами и скальпелем вырезают белое вещество мозга, стараясь не повредить кровеносные сосуды, а если это случается, обильно промывают холодной водой.

Около 30 г свежевыделенного белого вещества измельчают скальпелем или ножницами при добавлении 15 мл дистиллированной воды. Затем гомогенизируют на гомогенизаторе с тефлоновым пестиком, постепенно приливая смесь хлороформ — метанол (в соотношении 1:2). Вместо метанола можно брать этанол. Растворитель добавляют в соотношении 1 часть ткани : 5 частей смеси, т. е. 150 мл. В смесь необходимо добавить 0,1 мл а-токоферола для подавления реакций перекисного окисления липидов. Полученную суспензию разливают в стеклянные центрифужные пробирки и центрифугируют 10—20 мин при 4000— 6000 об/мии. Не рекомендуется использовать пластмассовые пробирки, так как они могут оказаться неустойчивыми к действию органических растворителей. Надосадочную жидкость сливают в колбу с притертой пробкой. К осадку прибавляют смесь хлороформ — этанол — вода (в соотношении 1:2: 0,8) и снова гомогенизируют. Гомогенат центрифугируют при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливают в ту же колбу с первой надосадочной жидкостью. Затем в эту колбу приливают хлороформио-водную смесь (1 : 1), встряхивают и полученную мутную (беловатую) суспензию центрифугируют 5—8 мин при 3000— 4000 об/мин. Следует оберегать суспензию от воды.

Центрифугат в пробирках расслаивается на три фазы: верхняя — метанол и вода, средняя — липопротеиды и нижняя — раствор липидов в хлороформе. Хлороформную фазу с липидами отсасывают шприцем, для освобождения от протеинов фильтруют через бумажный фильтр и собирают в пробирку с притертой пробкой. Препарат хранят в холодильнике.

Затем приступают к определению количества выделенных липидов. Это можно сделать двумя способами. Один из них заключается в следующем. Упаривают 0,5 мл выделенных липидов в роторном испарителе до образования тонкой липидной пленки. Затем взвешивают пробирку с липидами и по разности массы чистой пробирки и пробирки с липидами рассчитывают общий выход липидов.

Второй способ определения количества липидов основан на использовании фосфованилинового реактива. Принцип метода основан на том, что липиды после гидролиза серной кислоты взаимодействуют с фосфованилиновым реактивом с образованием красного окрашивания. Для этого к 0,02 мл раствора липидов добавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты, такое же количество кислоты приливают к 0,02 мл эталонного раствора. Содержимое пробирок выдерживают иа кипящей водяной бане 15 мин. Потом содержимое пробирок охлаждают в токе холодной воды и отмеривают в другие сухие пробирки гидролизат и проводят определение:

проба — 0,30 мл гидролизата-|-4,5 мл

реактива;

кЬнтроль — 0,30 мл гидролизата эталон-

ного pacTBopa-f-4,5 мл реактива;

раствор сравнения — 0,30 мл H2S04+4.5 мл реактива.

Содержимое пробирок перемешивают, оставляют стоять 40—50 мин. Измерение оптической плотности пробы и контроля осуществляют против раствора сравнения в кювете при 530 нм. По значениям оптических плотностей пробы (А) и контроля (В) рассчитывают содержимое липидов в 1 г/л пробы по формуле

x = ~^-Z, (67) где Z — концентрация липида в эталонном растворе. Полученный таким образом липидный раствор устойчив в течение нескольких месяцев при хранении его на холоду в условиях, исключающих прямой контакт с кислородом, и пригоден для формирования искусственных моно- и бислойных мембран.

Аналогичным образом можно проводить экстракцию липидов из других тканей. Если же выделение липидов проводят из фракций мембран, то стадия гомогенизации исключается, а применяемая смесь хлороформа с метанолом должна содержать более высокий процент хлороформа.

Контрольные вопросы и задания

1. Какова роль ляпидов в жизнедеятельности клетки и организма? 2. Расскажите о растворимости лнпндов. 3. Расскажите об индивидуальных липндах и нх содержании в мембранах с различной степенью функциональной активности.

3.18. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ЛИПИДНЫМИ МОНОСЛОЯМИ

Фосфолипидные везикулы, обладая поверхностной активностью, способны концентрироваться на поверхности воды, при этом разрушается их везикулярная структура и процесс в конце концов завершается образованием монослоя, пригодного для получения из него плоских липидных мембран по методу М. Монтала (см. 2.4). Липидные везикулы как модель биологических мембран в структурном отношении наиболее близки к естественным мембранам. При выделении из тканевых гомогенатов последние тоже приобретают замкнутую форму, но по многим другим показателям липосомы лишь упрощенно отражают процессы, происходящие в нативных мембранах. Однако поверхностно-активные свойства обоих типов мембранных структур не должны отличаться чрезмерно.

Поверхностная активность плазматических мембран и их взаимодействие с монослоями исследуется на границе раздела фаз водный раствор электролита — воздух по методике И. Ленгмюра. Монослои формируются в тефлоно-вой кювете с фиксированными размерами. В экспериментах фиксируются три параметра: изменение поверхностного натяжения, изменение граничного скачка потенциала и площадь монослоев.

Оборудование: установка для измерения характеристик монослоев подробно описана В. С. Геводом (1978). Электрическая' схема состоит из двух функциональных блоков: блока регистрации поверхностного натяжения Да. и блока регистрации граничного потенциала Да (рис. 104). л

Рис. 104. Блок-схема установ

страница 96
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)