еакции нельзя измерить в строго одинаковых условиях: их идентичность может соблюдаться с точностью до нуклеотида — субстрата. В связи с этим для исключения эффектов нуклеотидов на возможные Дц. Независимые изменения сродства Fi к лигандам начальные скорости обоих процессов были измерены при различных концентрациях АДФ (окислительное фосфорилирование) и АТФ (АТФазная реакция). При этом различия в кинетике обоих процессов, катализируемых препаратами, преинкубированными с АДФ, сохранились. Таким образом, АДФ можно рассматривать как ингибитор фермента с однонаправленным (по отношению к направлению реакции) действием.

Анализ кинетики АТФазной реакции

и механизм действия некоторых ингибиторов

и активаторов АТФазы [51, 52]

Крайне высокое сродство АДФ к митохондриальной АТФазе и АТФ-зависимая активация фермента приводят к тому, что постоянная скорость гидролиза АТФ во времени в присутствии АТФ-регенерирующей системы различными препаратами субмито-хондриальных частиц скорее исключение, чем правило. Это, по-

2*

35

видимому, обусловлено различным содержанием АДФ, а следовательно, деактивированного F4 в различных препаратах частиц. Кинетическое поведение митохондриальной АТФазы может быть унифицировано их «активацией» смесью содержащей фосфоенол-пируват и пируваткиназу. После такой обработки (~30 мин, '25°С, напомним, что константа скорости АТФ-независимой активации равна 0,2 мин-1) субмитохондриальные частицы или растворимый фактор Fi катализирует гидролиз АТФ в присутствии АТФ-регенирующей системы двухфазно: быстрая начальная фаза катализа сменяется более медленной. Следующие параметры кинетики нуклеозидтрифосфатазной активности оказались существенными для дальнейшего анализа. Двухфазность наблюдается только при гидролизе АТФ; другие нуклеозидтрифосфаты гидролизуются ферментом с постоянной скоростью. Уместно напомнить, что только АДФ обладает способностью образовывать «медленный» комплекс с АТФазой. Скорость перехода от первой ко второй медленной фазе гидролиза прямо пропорциональна скорости реакции, вариации которой достигаются использованием различных концентраций АТФ. Активация фермента обработкой пируватки-назой или его торможение в ходе гидролиза АТФ неконкурентны по отношению к АТФ: изменение каталитической активности сопровождается только изменением Vmax при постоянном значении Кт для АТФ. Ни скорость перехода от быстрой фазы к медленной, ни соотношение между активностями фермента в первой и второй фазах реакции не зависят от количества пируваткиназы и фосфоенолпирувата, использующихся в АТФ-регенерирующей системе.

Простейшая схема, хорошо соответствующая такому набору экспериментальных данных, может быть представлена в виде

±АТФЗ ±Ф„ _АЛФ

Е*--> Е¦ АТФ ^_1__?-АДФ - ^Е. (11)

медленно

?*-АДФ*

Схема (11) описывает обычную ферментативную реакцию, один из фермент-субстратных комплексов которой подвергается медленной изомеризации с образованием неактивного фермента. Сопоставление перечисленных выше параметров двухфазности гидролиза АТФ со свойствами «медленного» комплекса, образующегося при преинкубации АТФазы с низкими концентрациями АДФ, дает достаточные основания полагать, что неактивный комплекс Е-АДФ*, образующийся в результате изомеризации (схема 11),. и неактивный Е-АДФ комплекс идентичны.

Из приведенной выше схемы следует, что должны существовать эффекторы, по-разному влияющие на две фазы гидролиза АТФ^ это казалось особенно вероятным для тех модуляторов АТФазы.

36

влияние которых проявляется медленно и (или) конечный результат их действия зависит от природы гидролизующегося нуклеотида. Действительно, нам удалось показать, что влияние азида — ингибитора АТФазы [69—71] и сульфита — ее активатора [72, 73] опосредуется АДФ. Оказалось, что ни азид, ни сильфит не влияют на начальную стадию гидролиза АТФ, будучи ингибитором и активатором (соответственно) второй стадии реакции. Более того, скорость торможения АТФазы азидом, как и скорость перехода реакции во вторую, медленную фазу, прямо пропорциональна начальной скорости реакции. Сульфит предотвращает переход к медленной фазе реакции, когда он добавлен к среде раньше фермента, и активирует реакцию во второй ее фазе, или на фоне торможения азидом. Ни тот, ни другой эффекторы не влияют на скорость гидролиза ИТФ, а кинетический механизм их ингибирую-щего' (азид) и активирующего (сульфит) влияния на гидролиз АТФ неконкурентен по отношению к АТФ.

Принимая во внимание схему (11) и перечисленные выше факты, легко описать формальный механизм действия азида и сульфита:

±АТФ -ф„ —АДФ

Е---*Е - АТФ--->г-АДФ*--> Е

± азид

Е* • АДФ*---- Е* ¦ АДФ

азид

Как видно из схемы, оба эффектора не влияют на собственно АТФазную реакцию, а их действие связано с реакциями, приводящими к изомеризации «быстрого» Е-АДФ-комплекса в «медленный» (Е*-АДФ).

В подтверждение предложенной схемы мы показали, что сульфит предотвращает торможение АТФазы, вызванное преинкуба-цией фермента с низкими концентрациями АДФ, а азид блокирует активацию АТФазы фосфоенолпируватом и пируваткиназой.

Взаимодействие неорганического фосфата и митохондриальной АТФазы [54]

Поскольку неорганический фосфат является субстратом окислительного фосфорилирования, можно думать, что Fi имеет специфический центр его связывания. Действительно, растворимая АТФаза может связывать фосфат [6—8]с Кдис, соизмеримым со значениями Кт для этого субстрата в процессе окислительного фосфорилирования [74]. Если фосфотрансферазные реакции, происходящие при гидролизе АТФ, катализируемом растворимым Fi или субмитохондриальными частицами, рассматривать как про-

37

цесс, обратный окислительному фосфорилированию, протекающий по пути либо 1, 2, 3, 4, либо 1, 2, 5, 6 (либо по обоим), и реакции 3 или 6 обратимы, то неорганический фосфат должен быть ингибитором АТФазной реакции.

Е-АДФ

Однако это не так: фактически фосфат активирует АТФазную реакцию [75—77], а его влияние на АТФ-зависимые эндергониче-ские реакции субмитохондриальных частиц сложное и зависит от присутствия АДФ [78]. Такое парадоксальное влияние фосфата на АТФазную активность послужило предпосылкой для наших исследований, в которых было обнаружено сильное воздействие Фн на образование «медленного» комплекса Е-АДФ. Мы показали, что неорганический фосфат практически не влияет ни на Кт для АТФ, ни на Ki для АДФ (простой конкурентный тип торможения) в АТФазной реакции, катализируемой субмитохондриаль-ными частицами. В то же время величина константы диссоциации медленного комплекса Е-АДФ в присутствии 10 мМ Фн увеличивается на два порядка. Следует отметить, что предложенная нами ранее гипотеза, согласно которой высокоспецифичное к АДФ место связывания нуклеотида служит активным центром АТФазной реакции [50, 53], количественно плохо согласовывалось с величинами Кт для АДФ в процессе окислительного фосфорилирования. Сильное уменьшение сродства фермента к АДФ в присутствии фосфата, во-первых, сняло это противоречие, а во-вторых; позволило дать простую интерпретацию ряду ранее известных, но не