Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

объясненных фактов. Давно известно, что азид, будучи ингибитором АТФазы, ингибирует связывание фосфата фактором Fi, а сульфит увеличивает это связывание \[7]. Образование комплекса Fi с фосфатом — медленный процесс [6, 7], что плохо соответствует представлению о его вовлечении в каталитический цикл окислительного фосфорилирования. Оба этих явления логически вытекают из схемы (12), так же как и не объясненная ранее стимуляция АТФазной. реакции после преинкубации с неорганическим фосфатом [75—77]. Нам удалось показать, что неорганический фосфат, уменьшая сродство АТФазы к АДФ, медленно (с такой же скоростью, как и АТФ-регенерирующая система) активирует АДФ-блокированную АТФазу, и эта активация чувствительна к азиду.

К сожалению, из-за методических трудностей мы не можем различить два возможных варианта взаимозависимого связывания АДФ и Фц с митохондриальной АТФазой:

38

Е-АДФ-

±АДФ

>Е-Ф„

(И)

±Ф„

к3

ЬАДФ

К.,

±АДФ

-Е-АДф

±Ф„ •АДФ

(15)

Ф.

где KiАДф-Е*—---

+АДф|

АДф-Е*«АТф

-Фа

медленная А Тф -зависимая активация

.АДФ ¦ Фн "

+н2о

АТф

АТф-Е

,АДф ' Ф„

каталитический цикл

(16)

АДф«Е»АТф-

-АДФ

Е-АТф-

-АДф-Фн

АТф-Е

,АДф

Из схемы следует, что неорганический фосфат в стационарном состоянии должен стимулировать АТФазную реакцию, что противоречит нашим результатам [54]. Кроме того, если вслед за Бойером

¦АДФ

принять, что АДФ в тройном комплексе Е локализован в

• Ф

^*н

описанном нами центре с высоким сродством, то даже в присутствии фосфата число оборотов АТФазы не может быть больше 2 мин-1 (см. с. ООО).

Последнее явно противоречит фактам.

39

«Полная» модель кинетики гидролиза

АТФ митохондриальной АТФазой и проблема

обратимости гидролиза/синтеза АТФ

Суммированные в предыдущем разделе экспериментальные данные могут быть описаны минимальной кинетической схемой, представленной на рис. 1. Прежде чем обсуждать эту схему, целесообразно еще раз кратко повторить основные экспериментальные факты, послужившие предпосылками ее построения. Левый, больший цикл описывает простейшую последовательность реакций гидролиза АТФ. Существование последовательности реакций правого, малого цикла 5, 6, 7 следует из кинетики АТФ-зависимой активации

Рис. 1. Кинетическая схема гидролиза АТФ митохондриальной АТФазой. Прямыми стрелками показаны предполагаемые места действия ингибиторов и активаторов фермента. Подробное объяснение в тексте

АТФазы, заторможенной после преинкубации с низкими концентрациями АДФ. Связь между двумя циклами осуществляется реакцией 4, описывающей медленную изомеризацию фермент-продукт-ного комплекса Е-АДФ в комплекс Е*-АДф, где АДФ связан в центре, отличном от того, где связывается АТФ при гидролизе последнего (см. схему (И)). Превращение комплекса Е-АДФ в Е*-АДФ за счет изомеризации (или транслокации) нуклеотида из одного центра в другой без появления в растворе следует из зависящего от времени торможения освобожденной от АДФ АТФазы при гидролизе АТФ (но не других нуклеотидов) и отсутствия зависимости этого торможения от количества добавленной пируваткиназы.

Действие сульфита, по-видимому, обусловлено предотвращением реакции 4. Азид предотвращает АТФ-зависимую активацию АТФазы, блокированной АДФ; таким образом, его влияние направлено на одну из стадий: 5, 6, 7. По ряду соображений нам кажется наиболее вероятным, что азид предотвращает диссоциацию АДФ из тройного неактивного комплекса АДФ-Е*-АДФ.

Полное выражение для скорости гидролиза АТФ. в реакции, описываемой этой моделью, достаточно громоздко. Однако без

40

искажения сути модель может быть заменена более простой, экви валентной:

(17)

±S kt/ks

Схема (17) сохраняет все основные свойства более детализированной модели (рис. 1). Согласно этой упрощенной схеме фермент-субстратный комплекс одностадийной реакции (E-S) претерпевает необратимую изомеризацию (напомним, "что константа диссоциации комплекса Е*-АДФ очень мала, ~1G~8M). Неактивный комплекс -E-S может быть активирован субстратом через стадию образования тройного комплекса S-E-S (АТФ-зависимая активация АДФ-блокированного фермента). В присутствии избытка пируваткиназы стадии, описываемые константами скоростей &2 и ^ъ, необратимы. Сравним теперь кинетику АТФазной реакции, катализируемой «активированной» АТФазой, полностью освобожденной от АДФ и регистрируемой по начальным скоростям реакции (малый цикл — рис. 1 — не функционирует), с кинетикой реакции в стационарном состоянии, когда функционируют оба цикла.

В первом случае («активированная» АТФаза, начальные скорости) :

v = k2[E-S] (18)

s

[SJ + К

где tfs=Al+X (19)

Для стационарного состояния (функционируют оба цикла, измеряются скорости после установления медленного равновесия между комплексами E-S, E-S* и S-E-S):

w = ?2-[E-S]+?5[S-E-S]. (20)

Членом &5[S-E-S] в выражении (19) можно пренебречь, так как k5 примерно на четыре порядка меньше, чем kz. Другими словами, можно считать, что образование продукта реакции (АДФ) происходит только за счет собственно гидролитической реакции, а процесс активации АТФазы влияет на скорость за счет изменения концентрации E-S, а не за счет образования Р в результате его отщепления из тройного комплекса S-E-S.

41

Решение системы уравнений, описывающих стационарное состояние (вывод не приводится), выглядит следующим образом»

- v =-fea E°"S- (21)

s(i+-|)+^+A.^.

где K?m ----- —^--(константа Михаэлиса для АТФ в процессе

окислительной активации фермента). Как обсуждалось в предыдущем разделе, Кат численно равна К^. Выражение (20) тогда может быть преобразовано:

(22)

(» + *)(. +А)

Выражение (22) отличается от (19) добавочным членом в знаменателе, характеризующим относительные скорости изомеризации фермент-субстратного комплекса (ES) в неактивный (ES*) и активации под действием субстрата. Выражение (21) описывает неконкурентный тип торможения (по сравнению с (19)), что соответствует экспериментальным данным о неконкурентной по отношению к АТФ активации АТФазы инкубацией в присутствии фос-фоенолпирувата и пируваткиназы и о не

страница 11
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.11.2019)