Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

одящее к тому, что вместо специфической изомеризации комплекса «фермент-продукт» (реакции 3) происходит диссоциация комплекса в соответствии с последовательностью реакций 5 и 6. Суммарная АТФазная реакция в этом случае катализируется циклической последовательностью реакций 1, 2, 5 и 6, а если одна из новых стадий, например 5, необратима, невозможно обращение и всей последовательности реакций. При таком рассмотрении АТФазная и АТФ-син-тетазная реакции протекают по различным механизмам. Для необратимой последовательности реакций 1, 2, 5 и 6 соотношение Хол-дейна не имеет смысла. В том случае, если обе последовательности: /—4 и 1, 2, 5, 6 обратимы, то для каждой из них существуют два соотношения, связывающие кинетические параметры с константой равновесия, каждое из которых однозначно. Очевидно, что константа Михаэлиса для АТФ и значения максимальных скоростей гидролиза, протекающего по различным механизмам, могут существенно различаться; это в полной мере справедливо и для обратных реакций. При таком рассмотрении существование «односторонних» ингибиторов фермента не только возможно, но и прямо следует из схемы '[28]. Действительно, ингибитор, действие которого направлено, например, на стадию 5, не окажет влияния на реакцию фосфорилирования, но будет сильно влиять на реакцию гидролиза АТФ.

45

Следует отметить, что существование различных путей синтеза и гидролиза АТФ в митохондриях в неявном виде неоднократно предлагалось различными авторами в течение двух последних десятилетий [29—33], однако, по-видимому, из-за недостаточно-четких формулировок подобные гипотезы не получили развития. Частным случаем общей схемы [28] является представление, развиваемое Шефером и сотрудниками, согласно которому электрохимический потенциал ионов водорода является регулятором соотношения между потоками реагентов, проходящими по пути 1—6 и /—4 [88—90]. Согласно Шеферу, конформация Fi, определяемая по сродству фермента к аналогам нуклеотидов, сильно зависит от Д|д,Н+. Следствием этого является существование аналогов нуклеотидов, избирательно блокирующих либо гидролиз, либо синтез. АТФ [91].

Существование медленных переходов фактора Fj из активного в неактивное состояние, индуцируемых АДф и нечувствительных к изменению ДцН+ (медленность изменений активности фермента сама по себе служит сильным указанием на конформационные перестройки в молекуле белка [92]) открывает, на наш взгляд, новую возможность обсуждения соотношений между путями синтеза и гидролиза АТФ митохондриальной АТФазой.

Три экспериментально обоснованных факта служат основной предпосылкой нашей гипотезы. Во-первых, в присутствии второго субстрата окислительного фосфорилирования — неорганического фосфата — величина константы диссоциации медленного Fi-АДФ-комплекса соизмерима с величиной Кт для АДФ в процессе окислительного фосфорилирования. Во-вторых, преинкубация субмитохондриальных частиц с АДФ блокирует АТФ-гидролазную реакцию и не влияет на кинетику окислительного фосфорилирования. В-третьих, АТФ-зависимая активация АДФ-блокированной АТФазы (последовательность реакций 5—7 малого цикла на схеме рис. 1) сама по себе должна представлять АТФазную реакцию с числом оборотов 2 мин-1 (см. обсуждение механизма АТФ-зави-симой активации выше). Такое число оборотов этой АТФазной реакции в пересчете на величины активности составляет ~0,8 нмоль/мин на 1 мг белка (содержание Fb определяемое по титру олигомицина в наших препаратах, составляет ~0,4 нмоль/мин на 1 мг белка), или 0,01% от скорости АТФазной реакции, протекающей в соответствии с последовательностью 1—3 большого цикла схемы рис. 1. Можно представить, что обращение малого цикла и является последовательностью реакций, происходящих при окислительном фосфорилировании, где обнаруженный нами медленный комплекс Е-АДФ* служит фермент-субстратным комплексом нормального каталитического цикла2. Сказанное может быть

2 Ситуация, очевидно, значительно сложнее, так как такой упрощенный подход предсказывает, что максимальная активность АТФ-зависимых эндергониче-ских реакций (обратный перенос, трансгидрогеназа) должна быть меньше или равна 0,8 нМ/мин на 1 мг белка субмитохондриальных частиц. Реальные величины примерно в 100 раз выше этого значения; это, конечно, требует модификации простейшей схемы, приведенной на рис. 1.

46

иллюстрировано схемой, изображенной на рис. 2, в соответствии с которой существуют две конформацни фактора Fi — «гидро-лазная» и «синтетазная», а равновесие между ними контролируется нуклеотидами — субстратом и продуктом окислительного фосфорилирования (или АТФазной реакции).

Кинетически такая схема эквивалентна модели, представленной на рис. 1, в которой пути синтеза и гидролиза АТФ различаются. Существование двух форм фермента, катализирующих одну и ту же реакцию с различными кинетическими параметрами, на первый взгляд должно было бы привести к аномальной, не михаэли-совской кинетике гидролиза АТФ препаратами субмитохондриаль-ных частиц, что экспериментально не наблюдается [50]. Кажущееся противоречие, по-видимому, объясняется чрезвычайно низкой АТФазной активностью малого цикла (см. выше), и гидролиз АТФ, максимальная скорость которого составляет лишь доли процента от общей скорости гидролиза, не вносит ощутимого вклада в измеряемые кинетические параметры.

Наиболее существенное следствие предложенной нами модели состоит в том, что понимание механизма окислительного фосфорилирования требует детального изучения реакций малого цикла, а не большого. Следует подчеркнуть, что в настоящее время количество экспериментальных работ по изучению кинетики АТФазной реакции необозримо (см. [56—60]), тогда как кинетике реакций, непосредственно связанных с синтезом АТФ, посвящены лишь единичные работы ;[74, 79, 80]. По-видимому, это связано, во-первых, с экспериментальными трудностями изучения кинетики окислительного фосфорилирования, а во-вторых, с тем, что необычные эффекты АДФ до самого последнего времени рассматривались как регуляторные. Последнее заслуживает краткого обсуждения. Появление аномального кинетического поведения ферментов в биохимии вообще и применительно к АТФазе в частности нередко связывают с особенностями ферментов как регулируемых катализаторов. Весьма часто, однако (и это справедливо в отношении функционирования АТФ-синтетазы митохондрий), в стороне от обсуждения остается вопрос: что именно и для каких физиологических нужд регулируется аномальным немихаэлисовским поведением. Кроме явной несостоятельности общего утверждения о существовании «регуляторных» мест связывания для нуклеотидов в молекуле Fi слабой их стороной является отсутствие количественных оценок. Сродство Fi к АДФ при образовании «медленного» комплекса неактивной АТФазы чрезвычайно велико (К~Ю-в — в отсутствие фосфата и /С~Ю-в М — в присутствии «физиологических» концентраций фосфата). Это означает, что при реальных концентрациях АДФ в матриксе митохондрий специфическое для АДФ место связывания всегда насыщено нуклеотидом, и «регулирование» активности фермента внешним сигналом, реализующ

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)