аходится в неактивированной форме, а при возбуждении ткани — в активированной, при этом при нейтральном значении рН активность увеличивается в несколько десятков раз [3,32—34].

В высокоочищенном состоянии КФ получена из скелетных мышц [20, 23, 35], сердца [36, 37, 38] и печени )[39—42], а в частично очищенном виде она выделена из ряда других тканей. В качестве объектов для выделения фермента были использованы ткани кролика, акулы, крысы, быка, а также человека. Разработанный Кребсом и др. {35] метод выделения КФ основан на изо-электрическом осаждении и дифференциальном центрифугировании. Дополнительные этапы очистки включают осаждение сульфатом аммония, гель-хроматографию на сефарозе 4В и ионнообменную хроматографию на ДЭАЭЦ [20, 23]. Описаны и другие методы выделения—с помощью гидрофобной хроматографии [43], хроматографии по сродству на иммобилизованной фосфорилазе, специфических антителах, на кальмодулин-сефарозе [44—46]. Очищенная до гомогенного состояния КФ из скелетных мышц представляет собой большую молекулу с м. в. 1,27 x10е—1,33 X 10е [20, 23, 35]. Коэффициент седиментации ее равен 23—26 5 [20, 23, 47, 48]. При хранении фермента появляются агрегаты с коэффициентами седиментации 37 5 и 485 [23]. В двух разных лабораториях был определен аминокислотный состав молекулы КФ [20, 23]. Изо-электрическая точка фермента р! равна 5,77 [21]. В спектре поглощения имеется максимум при 279 нм и минимум при 251 нм [21].

КФ может диссоциировать на субъединицы только после обработки DS-Na. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии DS-Na дифференцировали сперва три полосы, соответствующие трем субъединицам КФ, обозначенным а, р, у. Полоса, принадлежащая а-субъединице, была разделена на две а и «'. Недавно Коэн и др. [49] обнаружили в молекуле КФ еще одну субъединицу — с м. в. 17 000 — и показали, что по своим физико-химическим параметрам, первичной структуре [50], а также по функции она близка к кальмодулину — Са^-связывающему белку, активирующему фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов [51—53]. Ряд авторов проводил определение молекулярного веса субъединиц [20, 22, 23, 37, 38, 54]. Наибольшие колебания м. в. наблюдали для а- и р-субъединиц: а — от 118 000 до 145 000, а' — от 133 000 до 140 000, р — от 108 0000 до 130 000, у — от 41000 до 48 000. На основе определения молекулярных весов и их весовых соотношений рассчитывали стехиометрию субъединиц [20, 23]. Результаты, полученные разными методами исследования,

S6

показали, что субъединицы присутствуют в эквимолярных количествах и м. в. протомера равен 320 000 [23]. Не всегда, однако, соблюдалось такое соотношение субъединиц. Так, в работе Хаякавы и др. [20] оно было равно 1:1:2, а при анализе КФ из мышц тихоокеанской акулы (Squalus acanthias) нашли, что отношение между а- и р-субъединицами сохраняется постоянным, а соотношение у-субъединицы варьирует от 1 до 8 и более [54]. Исследуя природу этого явления, авторы установили сходство между у-субъ-единицей и G-актином. Оба белка имеют одинаковый молекулярный вес (45 000) и сходный аминокислотный состав, за исключением 3-метилгистидина, найденного только в молекуле G-актина.

Наличие а'-субъединицы явилось следствием различия субъединичного состава КФ в красных и белых мышцах [22, 25], и количество ее отражает соотношение белых и красных мышц в смеси мышц конечностей и спины, используемых обычно для выделения фермента. В препаратах КФ из мышц кролика соотношение а : а' равно 10 : 1, а для мышиного фермента — отношение а : а' равно 1 : 1 [45]. И действительно, в белых и красных мышцах было показано существование 2 изозимов [55]. Благодаря тому что изозимы обладают различным сродством к Са^, их удалось разделить на колонке с кальмодулинсефарозой 4В [46].

Исходя из молекулярного веса фермента, равного в среднем 1,3 x10е, и молярных соотношений субъединиц, принято считать, что структура КФ из скелетных мышц отвечает формуле (офуб)4 или (a'Pi>6)4. Выделенная в гомогенном состоянии КФ из сердца также содержит по 4 моля а- и р-субъединиц, а количество у-субъединицы все же варьирует от 1 до 5, 6 [37,38].

В лаборатории Хейльмейера была выделена КФ из мембран саркоплазм этического ретикулума, в структуре которой не обнаружено у-субъединицы [56]. Высокоочищенный фермент печени имел структуру, сходную с мышечной КФ [42, 57]. Как уже указывалось, КФ в нативном состоянии не диссоциирует на субъединицы. Попытки вызвать диссоциацию путем разведения, повышением ионной силы в присутствии солей NaCl, КС1, NaN03, NaC104, выдерживанием при низкой температуре не увенчались успехом [3]. Однако в работе Скастера и др. [58] удалось отделить у-субъединицу от комплекса путем обработки фермента 1,8 М. LiBr в присутствии 100 мМ АТФ. Авторы получили при этом белок с м. в. 86 000, считая его димером уг- В дальнейшем в той же лаборатории таким способом были изолированы два комплекса уб и ауб, которые, как и у2, обладали ферментативной активностью [59].

Вопрос о наименьшем молекулярном весе активной формы нативного фермента до сих пор не нашел разрешения. Исследования КФ, активированной путем фосфорилирования [3,6], органическими растворителями [60], не дали ответа. Оказывает ли действие белковый субстрат ФБ на четвертичную структуру КФ, пока тоже не ясно. Хотя, если учесть, что между ФБ и КФ обнаружено образование комплекса с м. в. 750 000, то как будто такое влияние

57

имеет место [61]. С другой стороны, выяснилось, что, в отличие от неактивированной киназы, КФ, активированная протеолизом в присутствии АТФ при 5°С, превращается в компоненты с меньшим молекулярным весом — 350 000 и ниже [3]. Основываясь, однако, на результатах кинетики ингибирования КФ аналогами АТФ, инактивация фермента происходила при связывании 4 молекул необратимого ингибитора на молекулу киназы, и, следовательно, это указывало, что активной является высокомолекулярная форма фермента (офубЬ [62, 63].

Специфичность киназы фосфорилазы

Фишер и сотр. [64] установили, что продукт киназной реакции ФА характеризуется наличием фосфосеринового остатка. В полученном путем протеолиза ФА гексапептиде, а затем тетрадекапептиде [65], содержащем центр фосфорилирования, была определена последовательность аминокислот и показано, что фосфорилирован-ный остаток серина, занимающий положение 14 от N-конца, окружен двумя гидрофобными аминокислотами — изолейцином и ва-лином, рядом с последним находится аргинин:

Лиз-Глн-Иле-(Сер-Р)-Вал-Арг.

14 15 16

Эта последовательность аминокислот повторяется у фосфорилаз различных животных и человека [23, 66—68], и, по всей вероятности, поэтому КФ из мышц кролика способна катализировать фосфорилирование всех до сих пор известных фосфорилаз животного происхождения [68], в то время как дрожжевую ФБ, имеющую в этом участке иную последовательность, КФ не фосфорилирует [69]. Специфичность действия КФ исследовали с помощью синтетических пептидов. Кинетические свойства неактивированной и активированной КФ, изученные в модельной системе, содержащей вместо ФБ синтетический тетрадекапептид, указыв