полученные методом поперечной сшивки с помощью диметилсубе-римидата [122, 123] и электронномикроскопические исследования ,[124]. Сшивающий агент может взаимодействовать с компонентами комплекса, расположенными на достаточно близком расстоянии друг от друга. Так, например, полученный после сшивки поли-пептид с м. в. 60 000 [122] был расшифрован как комплекс, состоящий из двух субъединиц — уб. Исследуя субъединичную структуру сшитых комплексов на основе их чувствительности к действию определенных протеиназ, можно было предположить, что по-.лученные сочетания субъединиц — уб, Руг, оф, асе — обусловлены более тесным контактом их в пространственной организации молекулы. Исследование КФ методом электронной микроскопии показало, что молекула имеет форму буквы Н: она представляет собой структуру, состоящую из двух больших доменов, соединенных узким мостиком. Каждый домен разделен на две половины, и мостик находится около участка их соединения. Размеры больших 'частей позволяют предположить наличие 2а- и 2р-субъединиц в каждой части. Мостик, соединяющий эти части, может включать в себя у-субъединицы. На основе данных электронной микроскопии « результатов, полученных при сшивании субъединиц, была предложена гипотетическая схема строения КФ, согласно которой 2а-н 2р-субъединицы находятся в множественных контактах, а мостик, состоящий из 4 у-субъединиц, расположен таким образом, что р-субъединица одновременно может контактировать с 2у-субъеди-ницами [123, 124].

Между тем появился ряд работ, сообщавших новые сведения о функциональной роли р-субъединицы. Это направление исследований представлено работами, в которых широко использовались различные аналоги субстрата — АТФ. В нашей работе были испытаны аналоги АТФ, содержащие алкилирующую группировку в •з-рифосфатном участке молекулы [62, 63]. Среди испытанных аналогов АТФ наиболее эффективным ингибирующим действием характеризовался аденозин-5'-хлорметанпирофосфонат, образующий •необратимый фермент-ингибиторный комплекс. Наблюдаемый защитный эффект АТФ и стехиометрическое включение радиоактивных аналогов в молекулу КФ указывали на то, что эти соедине-

64

ния взаимодействуют с функциональными группами активного центра и, следовательно, связывались с теми субъединицами, на которых локализованы активные центры фермента. При изучении включения радиоактивной метки, содержавшейся в аналогах АТФ, мы получили доказательство того, что они присоединяются к р"- и у-субъединицам. Для полной инактивации фермента было достаточно, чтобы по одному молю аналога присоединилось к р-и ¦у-субъединицам. Найденная нами зависимость между степенью инактивации фермента и степенью модификации р-субъединицы позволяет трактовать полученные данные как доказательство участия р-субъединицы в каталитическом процессе (табл. 2).

Весьма сходные результаты получены недавно другими авторами [125—128], наблюдавшими влияние ряда соединений, близких по структуре к АТФ, на ферментативную активность и на взаимодействие с субъединицами КФ. Полученные ими данные показали, что используемые соединения конкурируют за места связывания с АТФ или АДФ. Анализ взаимодействия с [у- 32Р] 8-азидоаденозии-5'--трифосфатом указывал на преимущественное мечение р-субъединицы фермента и на защиту ее от включения метки в присутствии АТФ или АДФ [127, 128J. Таким образом, влияние аналогов АТФ на ферментативную активность в сочетании с включением их в р- и у-субъединицы позволяет полагать, чтор-субь-единица играет существенную роль. Подтверждают эту точку зрения также данные недавно опубликованной работы, проведенной на КФ из сердца быка [38].

Поскольку выделить в индивидуальном виде р-субъединицу пока не удалось, нельзя решить однозначно, какова ее роль в каталитическом процессе. Однако для выяснения этого вопроса помимо вышеописанных могут быть использованы и другие подходы. В частности, могут быть полезны методы химической модификации функциональных групп, вовлекаемых в ферментативную реакцию или в регуляцию активности фермента. С этой целью проводилось изучение содержания и реакционной способности SH-групп КФ. В денатурированной молекуле определили 160 [20] или 200 [23] остатков цистеина. В работе этих же авторов было замечено, что SH-группы характеризуются различной реакционт ной способностью, но детально значение их не исследовалось.

В нашей работе было показано, что блокирование SH-групп дитионитробензоатом и йоданетамидом, обладающих наиболее высокой реакционной способностью, связано с активацией фер-

Таблица 2

Зависимость степени инактивации кф от степени модификации В- и Y-субъединиц фермента аденозин-5'-хлорметапирофосфатом

Остаточная активность фермент-ннги-биторного комплекса Количество аналога, [связанного с субъединицами, моль/моль o.Pv6. R-субъеди-ница Y-субъеди-ница

90 0.1 1,0

50 0,4 1,2

0 0,7—0,9 1,3

3 Заказ 423

65

мента, в то время как медленно реагирующие SH-группы, подразделявшиеся на две категории, имели существенное значение для проявления ферментативной активности. Это подтверждалось зависимостью между скоростью блокирования SH-групп и наблюдавшейся инактивацией фермента [129, 130]. Принимая во внимание тот факт, что субстрат и продукт реакции, АТФ и АДФ, защищали фермент от инактивации, мы исследовали зависимость этого эффекта от концентрации нуклеотидов, добавленных порознь и совместно, и его связь с модификацией SH-групп. Результаты титрования, приведенные в табл. 3, позволили прийти к заключению о пространственной разделенности защищаемых SH-групп и о локализации их в области нуклеотид-связывающих центров. ' На основе зависимости защитного действия нуклеотидов от их концентрации можно было предположить что два остатка цистеина находятся в области АТФ-связывающих центров, отличающихся по сродству к субстрату, а один остаток — в области нуклеотид-связывающего участка, имеющий большее сродство к АДФ. Количество защищаемых нуклеотидами SH-групп не зависело от присутствия ионов Mg2+.

Следующий этап нашей работы был связан с выяснением локализации SH-групп, важных для ферментативной активности, в субъединицах КФ. Для этого препараты фермента, предварительно обработанные иС-йодацетами-дом в присутствии и в отсутствие

Таблица 3

Влияние АТФ и АДФ на защиту остатков цистеина киназы фосфорилазы от модификации _дитионитробензоатом_

«У?

Условия

Количество защищаемых +SN-групп на прото-мер aPvo

АТФ (0,05 мМ)

АТФ (0,3 мМ)

АТФ (3,0 мМ)

АДФ (0,05 мМ)

АДФ (0,3 мМ)

АДФ (3,0 мМ)

АТФ (0,3 мМ)+АДФ (О.ЗмМ)

АТФ (0,3 мМ)+АДФ (3 мМ)

АТФ (3 мМ)+АДФ (3 мМ)

0,98±0,29 0,83+0,26 2,63+0,20 1,16±0,10 0,68±0,20 1,96±0,15 1,98±0,10 1,95+0,47 2,88+ДЗЗ

Примечание. Концентрация киназы — 0,4 мг/ мл; дитионитробензоата — 40 мкМ.

Рис. 3. Взаимодействие [мС]-йодацетамида с субъединицами киназы фосфорилазы.

КФ (0,4 мг/мл) инкубировали с [14С]-йодацетамндом при 30°С в 50 мМ р-глице-рофосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 10%-н\!ю сахарозу, 1 мМ ЭГТА. Радиоактивность измеряли в срезах полиакриламидного геля, полученных п