осле электрофореза в присутствии DS-Na. / — в отсутствие Mg-АТФ,. 2 — в присутствии 10 мМ MgCt и 3 мМ АТФ

66

АТФ, анализировали путем электрофореза. Рис. 3 демонстрирует включение радиоактивной метки в субъединицы фермента. Как видно, в присутствии АТФ радиоактивность а-субъединицы не изменялась, а включение радиоактивности в р- и у-субъединицы заметно уменьшалось. Этот результат подтвердился при поэтапной обработке КФ йодацетамидом. На первом этапе инкубировали КФ с нерадиоактивным йодацетамидом в присутствии АТФ, а после диализа этот же препарат фермента обработали [ИС]-йодацетамидом. Защищенные в присутствии АТФ SH-группы на первом этапе обработки прореагировали с [ИС]-йодацетамидом на втором этапе. Радиоактивность в этом опыте была обнаружена на р- и у-субъединицах [130]. Взаимодействие КФ с [14С]-йод-ацетамидом в присутствии варьирующей концентрации АТФ или АДФ позволило подтвердить предположение о наличии двух ну-клеотид-связывающих центров на р-субъединице и одного на у-субъединице.

Таким образом, накопленные к настоящему времени результаты поддерживают гипотезу о значении р-субъединицы для каталитического процесса. Однако, участвует ли она непосредственно в реакции или выполняет регуляторную роль, влияя на ферментативную реакцию, путем кооперативных взаимодействий р- и у-субъединиц, в настоящее время остается неясным.

Регуляция активности киназы фосфорилазы ионами Са и кальмодулином

Одной из особенностей функционирования КФ скелетных мышц является полная зависимость ее активности от ионов Са2+, обнаруженная впервые в работе Фишера и Кребса [131]. Особый интерес к исследованию этого явления появился после того, как ¦была показана обратимость активации фермента при низкой концентрации Са2+ [132] и когда в ряде работ подтвердилось, что КФ проявляет свою активность при физиологической концентрации металла [9, 132, 133]. Количество Са2+ в цитоплазме мышечной клетки, как известно, зависит от состояния ткани. Установлено, что переход от покоящегося в возбужденное состояние сопровождается изменением концентрации Са2+ от 10-8—10~7 до 10-6—Ю-5 М [134]. Такое изменение концентрации свободного Са2* обусловлено механизмом сокращения мышц, связанным с .выбросом Са2+ в цитоплазму из саркоплазматического ретикулума, в котором локализована большая часть внутриклеточного Са2+.

Несмотря на то что многие вопросы сложных взаимодействий фермента с Са2+ оставались неясными, описанные факты послужили основанием гипотезы, связавшей нервное возбуждение мышц и выделение Са2+ в цитоплазму с ускорением процесса гликогенолиза [9, 47, 114].

Исследование кинетики активации КФ в зависимости от концентрации Са2+ и кинетики связывания его с ферментом показало, что между этими процессами существует корреляция. Величины

3*

67

констант диссоциации и Кт довольно хорошо совпадали [9]. Однако оказалось, что различные формы КФ обладают различной чувствительностью к ионам Са2+. Концентрация металла для полумаксимальной активации фосфорилированного фермента соответственно равна 1,6 и 0,6 мкМ при рН 6,8 и 8,2, а для неактивированной КФ эта величина равна 16 мкМ при рН 8,2 [19]. На основании этих данных можно было заключить, что изменение концентрации Са2+, а также фосфорилирование фермента и, по-видимому, изменение концентрации ионов Н+ в клетке взаимосвязаны и непосредственно влияют на регулирование активности КФ.

О связи между регуляцией активности КФ ионами Са2+ и мышечным сокращением свидетельствовали данные ингибирования ферментативной активности при добавлении изолированного СПР и реактивации ее при добавлении Са2+ [9], а также результаты, полученные на протеин-гликогеновом комплексе, содержащем все ферменты синтеза и распада гликогена и в какой-то степени имитировавшем функционирование фермента в мышечной клетке [8]. Гистохимические исследования, показавшие локализацию глико-геновых частиц вдоль тонких филаментов, указывали на возможность взаимодействия ферментов обмена гликогена с миофибрил-лярной фракцией [135]. Это подтверждалось также работой По-глазова и др. [136, 137], в которой наблюдали специфическую активацию КФ актином — основным структурным белком тонких мышечных волокон.

В изолированном протеин-гликогеновом комплексе не происходило превращение ФБ в ФА в отсутствие Са2+. При микромолярной концентрации металла наблюдавшаяся активация процесса еще более возрастала при добавлении гликогена, который в отсутствие Са2+ ингибировал реакцию, несмотря на достаточное количество присутствующих Mg2+ и АТФ, также важных регуляторов активности КФ [8].

В пользу зависимого от Са2+ связывания КФ со структурными компонентами клетки служили опыты, в которых происходила сорбция фермента на везикулах СПР в присутствии 10 мкМ СаН и десорбция при уменьшении его концентрации в среде [138]. Образование комплекса КФ с мембранами СПР, сопровождавшееся повышением ферментативной активности, могло быть связано с действием липидной фракции мембран [60].

Полная зависимость КФ от Са2+ была показана не только для фермента из скелетных мышц кролика, но и КФ из мышц других животных и КФ из сердца. Интересно отметить, что для фермента из мышц акулы активация Са2+ является основным способом ее регуляции, так как она не фосфорилируется в присутствии различных протеинкиназ или путем аутофосфорилирования. Для по-лумаксимальной-активации КФ акулы требовалось Зх Ю-7 М Са2+ [139]. Активность КФ из сердца полностью ингибировалась 0,5 мМ. ЭГТА и восстанавливалась при добавлении Са2+; для неактивированной и фосфорилированной КФ сердца величины Кт для Са2+-

68

соответственно равны 1,94 и 1,35 мкМ [37]. Весьма высокая чувствительность к ионам Са2+ характерна для КФ кровяных пластинок, для которой определены две величины Ка' 0,25 и 2,5 мкМ [140]. Следует также отметить, что при агрегации тромбоцитов наблюдали значительную активацию гликогенолиза ионами Са2+ [141]. Таким образом, исследованиями препаратов КФ, полученных из различных источников, подтверждалась активация их ионами Са2+, однако характеристики этой активации зависели от физиологических особенностей ткани. В целом ряде случаев потребность в Са2+ не являлась абсолютно необходимой, от 50 до 90% активности обнаруживалось при добавлении ЭГТА. Так, например, активность КФ печени зависит от Са2+ не более чем на 30—40% [142—144]. В отсутствие Са2+ активна также КФ жирового тела шелкопряда [145], летательных мышц мясной мухи [146]. Изучая активность КФ различных тканей крысы, японские авторы подразделили ее на два типа: мышечный и печеночный. К первому типу отнесли фермент, обладающий сильной зависимостью от Са2+ — КФ из скелетных мышц и сердца, а ко второму — слабо зависимую от Са2+ — фермент из печени, почек, селезенки и легких, КФ мозга занимала промежуточное положение^ [147]. При изучении активности КФ лейкоцитов человека оказалось, что требовавшаяся для неактивированной формы фермента концентрация Са2+ была равна Ю-7—5хЮ_6 М, а активированная форма проявляла свою активность в области концентраций от 10-9 до Ю-3 М [148].

В связи с высокой чувс