вается только через одну из субъединиц. В опытах с гли-цер альдегид- 3-фосфатдегидро-геназой из разных источников и с лактатдегидрогеназой мы использовали степень активации носителя, соответствующую добавлению 5 мг BrCN на 1 г влажного геля сефарозы или 3 мг на 1 мл уплотненного геля. Ни в одном из многочисленных экспериментов не наблюдалось связывания ферментов более чем через одну из субъединиц. Следует отметить, что количество связывающихся с носителем субъединиц зависит не только от количества добавленного для активации BrCN, но и от присутствия в среде для иммоби-буфера. Так, при введении 2-меркаптоэтанола в концентрации 4 мМ иммобилизация глице-ральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц осуществляется только через одну субъединицу даже при добавлении 20 мг BrCN на 1 мл уплотненного геля сефарозы [9, 10].

Описанные выше опыты свидетельствуют также, что иммобилизации на матрице в указанных условиях подвергается именно тетрамерная форма фермента, поскольку при низких степенях активации носителя содержание белка на матрице после обработ-

Таблица 1

Зависимость количества связанного с сефарозой фермента и его активности от степени активации носителя бромцианом

Дегидрогенаэа Количество BrCN, добавленного иа 1 мл геля, мг Количество белка иа сефароэе, мкг/мл геля Активность дегидрогеназы, ед/мг белка Количество белка на сефароэе после обработки 6 М мочевины, мкг/мл геля

Из скелетных 4 60 54 14

мышц крысы 10 90 45 30

20 160 30 65

50 340 16 240

100 430 14 320

200 430 14 320

Из дрожжей 5 130 57 32

30 320 26 —

100 470 15 —

150 500 15 —

лизации различных компонентов

82

ки мочевиной снижается в 4 раза. Из опытов с растворимым» глицеральдегид-3-фосфатдегирогеназами известно, что степень-олигомерности этого фермента никогда не превышает четырех, а диссоциация на димеры тетрамера дегидрогеназы начинается при: концентрациях ниже 0,200 мг белка в 1 мл или в специфических условиях, вызывающих такую диссоциацию.

Более сложная ситуация наблюдалась нами с лататдегидро-геназой из скелетных мышц свиньи при ее иммобилизации на активированной BrCN сефарозе [11]. При иммобилизации лактатдегидрогеназы на сефарозе Чан с соавт. обнаружили, что с матрицей связывается димерная форма фермента [8]. Аналогичные* результаты были получены в нашей работе при иммобилизации препаратов лактатдегидрогеназы, хранившихся в течение года [11]. Непосредственно после иммобилизации с матрицей связывается тетрамерная форма фермента, но 16-часовая инкубация* препарата при 4° С приводит к его диссоциации на димеры. Диссоциация «свежего» препарата лактатдегидрогеназы, иммобилизованного на сефарозе, происходит в незначительной степени [11]. В принципе оба препарата (иммобилизованные димеры и иммобилизованные тетрамеры) могут быть использованы для получения связанных с матрицей мономеров, но обязательным предварительным условием эксперимента является проведение опытов,, позволяющих однозначно судить об исходной степени олигомерности иммобилизованных форм.

Получение иммобилизованных мономеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ

Для получения связанных с матрицей мономерных форм ферментов используют, как правило, прием, предложенный Чаном в> 1970 г. [12]. Метод заключается в обработке олигомерных белков, ковалентно иммобилизованных через одну из субъединиц, в* жестких условиях, приводящих к полной денатурации всех субъединиц и разворачиванию всех полипептидных цепей. Несвязанные с матрицей ковалентной связью полипептидные цепи переходят в раствор, а последующее удаление денатурирующего агента должно приводить к постепенной ренатурацин иммобилизованной субъединицы. Основным недостатком метода является наличие .стадий денатурации и ренатурацин иммобилизованного мономера, поскольку последний процесс никогда не протекает со 100%-ной эффективностью. С помощью описанного подхода авторам, предложившим его, удалось получить активные мономеры альдолазы и трансальдолазы, однако удельная активность изолированных мономеров была значительно ниже, чем исходных олигомерных форм [13, 14]. В большинстве же случаев активность выделенных таким способом мономеров ферментов полностью отсутствовала или была крайне низкой. Следует также отметить, что выделение мономерных форм с низкой удельной активностью практически не позволяет прийти ни к какому конкретному выводу о роли'

83

четвертичной структуры в осуществлении катализа. Дело в том, •что низкая удельная активность \мономерных форм может объясняться по крайней мере тремя разными причинами. Во-первых, распад олигомера на субъединицы может приводить к уменьшению активности последних за счет разрыва межсубъединичных контактов, необходимых для эффективного протекания ферментативной реакции (и только эта ситуация могла бы представлять -интерес с точки зрения понимания смысла олигомерного строения чрерментов). Во-вторых, при получении иммобилизованных мономеров никогда нельзя полностью исключить возможность присутствия в препарате некоторого количества олигомерных форм, а также взаимодействия части иммобилизованных субъединиц друг с другом непосредственно на матрице. По этим причинам препарат иммобилизованных субъединиц, на самом деле полностью неактивных, может иметь незначительную способность к катализу. Третьей и, на наш взгляд, наиболее частой причиной снижения удельной активности мономерных форм может быть неполное восстановление их ферментативной активности в процессе ренатурации субъединиц.

Нами были проведены эксперименты по получению мономеров -иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей по методу Чана. Оказалось, что в условиях, приводящих к полной денатурации субъединиц, полученные мономеры не обладали каталитической активностью. Добавление к используемому для денатурации раствору 8 М мочевины кофактора, дити-отреитола или 2-меркаптоэтанола, оказывающих на фермент стабилизирующее действие, а также введение этих соединений на стадии ренатурации не приводит к получению активных мономеров [15, 16].

Кроме метода Чана существовал еще один подход, позволивший многим исследователям получить активные иммобилизованные формы с меньшей степенью олигомерности, чем исходный нативный фермент. Метод заключается в использовании специфических условий диссоциации, как правило, известных, из опытов в растворе и достаточно мягких. В большинстве экспериментов в таких специфических условиях происходит распад иммобилизованного олигомера на активные субъединицы или на активные агрегаты субъединиц (например, димеры в случае глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы). Однако такой подход не всегда позволяет получить иммобилизованные мономерные формы. Так, для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы доказаны очень высокая прочность связи между мономерами, которые образуют так называемый «функциональный димер», и отсутствие в неденатурирую-щих условиях процесса распада фермента на отдельные субъединицы [17, 18]. По этой причине для дегидроген