азы не удается подобрать условия, специфически вызывающие диссоциацию фермента на активные субъединицы.

В наших работах был предложен новый методический прием, позволяющий получать активные субъединицы олигомерных фер-

84

ментов в денатурирующих условиях (например, при высоких концентрациях мочевины). Предложенный метод иллюстрирует рис. 1. Сущность метода заключается в подборе таких условий денатурации, в которых происходят инактивация и переход в растворимое состояние всех субъединиц, кроме связанных с матрицей ковалентно. Важно отметить, что последние не подвергаются де-

Рис. 1. Схема получения препаратов иммобилизованных мономеров в условиях, вызывающих денатурацию всех субъединиц фермента, за исключением субъединицы, связанной с матрицей ковалентно. / — каталитически активная конформация субъединиц, 2 — неактивная конформация, 3 — полностью денатурированные субъединицы

натурации и полностью сохраняют свою активность на всех стадиях обработки. Основной предпосылкой при разработке метода •служили наблюдения о стабилизирующем действии иммобилизации на ковалентно связанные с матрицей субъединицы. Результаты опытов по инактивации иммобилизованных на сефарозе через •одну субъединицу тетрамеров глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-назы из дрожжей приведены на рис. 2.

Из приведенных данных следует, что в начальный период инкубации в 8 М мочевине происходит быстрая 50%-ная инактивация, а затем этот процесс замедляется. После снижения активности до 25% от исходной инактивация прекращается и в течение 2 ч активность препарата остается неизменной. Определение содержания белка в препарате на разных стадиях инкубации показывает, что 50%-ное снижение активности сопровождается двукратным снижением количества белка, т. е. с наибольшей скоростью инактивируется несвязанный непосредственно с носителем

40 80 120 160 200 240 Время инкубации, мин

Рис. 2. Зависимость активности и содержания белка в иммобилизованных тетрамерах глицеральде-гид - 3 - фосфатдегидрогеназы из дрожжей. Фермент инкубировали в 8 М мочевине, приготовленной на 0,1 М фосфате натрия (рН 7,6, 5 мМ ЭДТА и 2 мМ днтиотреитол), при температуре 28°С

85

димер дегидрогеназы. Более медленно инактивируется субъединица, ассоциированная с ковалентно иммобилизованным на носителе мономером (снижение активности до 25% от исходной), причем в течение 60—80 мин инкубации эта субъединица остается в связанном с носителем состоянии, так как содержание белка на носителе не изменяется. Через 140—180 мин инкубации полностью сохраняет свою активность ковалентно связанный с матрицей мономер дегидрогеназы. Следует отметить, что выделенный иммобилизованный мономер, вновь подвергнутый обработке мочевиной, довольно быстро (за 10 мин) полностью теряет свою активность. Вероятно, сохранение активности мономера в течение 3 ч инкубации обусловлено тем, что в составе тетрамера и димера связанные с ним уже неактивные субъединицы защищают мономер от денатурации. Снижение содержания белка на носителе до 75% от исходного происходит только через 140—180 мин инкубации, т. е. в период сохранения 25%-ной активности от исходной происходит постепенное удаление неактивной субъединицы из состава димера. Если через 140—160 мин инкубации в мочевине отмыть препарат дегидрогеназы от денатурированного белка, то можно получить мономеры, связанные ковалентно с матрицей и полностью сохранившие свою активность.

Предложенный подход был апробирован нами при получении мономеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика. Дегидрогенаэа из этого источника значительно менее устойчива к действию денатурирующих агентов, чем фермент из дрожжей, поэтому для получения мономеров мы использовали инкубацию при более низкой концентрации мочевины: (4,0 М).

При инкубации препарата иммобилизованного фермента наблюдалась ситуация, аналогичная описанной выше для фермента из дрожжей. Подбор условий для получения мономеров заклю-

Таблица 2.

Реактивация иммобилизованных мономеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с денатурированными субъединицами из раствора

Тип препарата дегидрогеназы Содержание белка Удельная активность, %

мкг/мл % 1. Иммобилизованные тетрамеры дегидрогеназы из

230±5 100 100

2. 62±2 27 26

3. Реконструированные тетрамеры (после реассоциа- 202±4 84

ции с денатурированными субъединицами) .... 88 1. Иммобилизованные тетрамеры из мышц кролика . 127±4 100 100

2. 35±2 27 26,5.

3. 109±4 86 67

86

чается лишь в варьировании концентраций мочевины и в выборе такой концентрации, при которой наблюдается плато после снижения активности на 75% от исходной. В начале этого плато в препарате содержится димер, состоящий из одной активной и связанной ковалентно с матрицей субъединицы и ассоциированной с ней неактивной субъединицы, а в конце плато — только активная иммобилизованная субъединица. Для того чтобы инактивирован-ная субъединица успела перейти в раствор, продолжительность плато должна быть не менее 30 мин.

Препараты иммобилизованных мономеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из обоих источников были способны к ре-ассоциации с субъединицами гомологичных ферментов из раствора (табл. 2). Для реассоциации использовали предварительно денатурированные в мочевине субъединицы дегидрогеназ, которые трижды в 8-кратном избытке добавляли к препаратам мономеров.

Увеличение содержания связанного с носителем белка свидетельствует об образовании в ходе реассоциации тетрамерных форм, однако в случае фермента из мышц не удалось добиться полного восстановления их активности.

Удельная активность иммобилизованных мономеров глицераль-дегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей и скелетных мышц кролика практически не отличается от активности иммобилизованных тетрамеров этих ферментов.

Получение иммобилизованных мономеров лактатдегидрогеназы

Показанная выше возможность выделения активных мономеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ свидетельствовала, что для осуществления каталитического акта этим ферментом четвертичная структура не является обязательной. В то же время в литературе существовали данные, что для лактатдегидрогеназы, у которой в значительно меньшей степени выражены кооперативные взаимодействия между субъединицами, объединение по крайней мере двух субъединиц необходимо для протекания ферментативной реакции [8] или для ее значительного ускорения [6, 7].

Для выяснения причин имеющихся противоречий нами было проведено выделение мономеров лактатдегидрогеназы по разработанному для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы методу и сравнение свойств полученных мономеров со свойствами тетрамеров [11]. Оптимальными условиями для получения мономеров лактатдегидрогеназы является инкубация исходного препарата тетрамера в присутствии 4,6 М мочевины в течение 120—150 мин; 75%-ная инактивация фермента происходит через 7О-—100 минут инкубации, затем активность препарата остается неизменной в течение 50 мин, а содержание белка снижается до значе