ний, характерных для мономерной формы. Таким образом, так же как для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, в ходе инактивации наблюдается плато, причем отобранные в конце этого плато пре-

87

параты содержат иммобилизованные мономеры. Время, необходимое для достижения плато, зависит от характеристик исходного препарата иммобилизованных тетрамеров: чем дольше до начала эксперимента хранились растворимый препарат дегидрогеназы или иммобилизованные тетрамеры, тем быстрее протекал процесс инактивации. Однако во всех случаях наблюдалось плато на кривой инактивации. Полученные иммобилизованные мономеры обладали способностью к реассоциации с субъединицами из раствора и удельной активностью, практически не отличающейся от активности иммобилизованных тетрамеров. Таким образом, для появления каталитической активности нет необходимости в объединении субъединиц в олигомер. Причиной низкой или нулевой активности мономеров лактатдегидрогеназы в других работах, по нашему мнению, может быть неспособность денатурированных' субъединиц к восстановлению третичной структуры после удаления мочевины или крайняя медленность этого процесса. Возможно, восстановление структуры начинается только после добавления* извне растворимых субъединиц, т. е. в ходе реассоциации. Вероятно, для полноценного сворачивания полипептидных цепей необходимо их взаимодействие. При получении мономеров по предложенной нами методике третичная структура связанных с матрицей мономеров не изменяется и, следовательно, стадия ренатурации может быть исключена.

В таблице 3 суммированы имеющиеся к настоящему времени сведения о каталитической активности мономерных форм дегидрогеназ. Из таблицы следует, что в большинстве случаев мономерные иммобилизованные формы дегидрогеназ обладают способно-

Таблица 5-

Каталитическая активность мономерных иммобилизованных форм НАД-зависимых дегидрогеназ

Фермент Исходная степень олигомер-ности Активность иммобилизованного мономера, % Способ получения мономера Активность после реассоциации, % Ссылка

•Лактатдегидрогеназа тетрамер 14—23 контролируемая 62—75 [И]

денатурация

Глицеральдегиддегидроге- тетрамер 20—25 то же 84—88 [15, 16]

, наза из дрожжей 22—27 65—70

Глицеральдегиддегидроге- тетрамер то же

наза из мышц кролика 119]-

Малатдегидрогеназа димер 77 диссоциация 94 при рН 5,0 [20]

Алкогольдегидрогеназа днмер 2-8 полная денату- 43

рация 108—114 [6, 7]

Лактатдегидрогеназа тетрамер 10—16? полная денату-

рация 58 [81

То же димер отсутст- то же

вует

88

-стью к катализу в отсутствие межсубъединичных контактов. -Причины возможной инактивации мономеров лактатдегидрогеназы в работах [6—8] были разобраны нами выше. Получение практически неактивных мономеров алкогольдегидрогеназы, вероятно, •также обусловлено их денатурацией при обработке в жестких условиях, причем восстановления активности не наблюдается даже -после реассоциации с субъединицами из раствора. Возможно, что .применение иных условий обработки позволит и в этом случае ¦получить полностью активные субъединицы.

Функциональное значение объединения субъединиц НАД-зависимых дегидрогеназ

В ьастоящее время существует довольно ограниченная информация в отношении вынесенной в заголовок этого раздела проблемы. Наиболее очевидной и довольно давно доказанной функцией такого объединения является стабилизация субъединиц в составе олигомера. Поскольку в литературе долгое время главенствовали представления об отсутствии каталитической активности у мономерных форм дегидрогеназ, считалось очевидным также первостепенное значение объединения субъединиц для осуществления катализа и регуляции активности НАД-зависимых дегидрогеназ.

В наших работах с иммобилизованными димерными формами глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ из различных источников -было установлено, что для проявления большинства кооперативных взаимодействий между субъединицами достаточно объединения двух субъединиц [21, 22]. Таким образом, осуществление катализа и регуляции возможно уже на уровне димерной формы. Мы обнаружили также, что иммобилизованные даже через одну субъединицу димеры обладают значительно большей стабильностью, чем димеры в растворе. Можно предположить, что in vivo такая стабилизация димеров, находящихся в равновесии с тетра: мерами, осуществляется за счет их взаимодействия с функционально связанными ферментами или структурными белками, т. е. функционирующей формой фермента в клетке может являться не тетрамер, а стабилизированный димер.

Оставалось, однако, непонятным функциональное значение объединения двух субъединиц в димер. Дело в том, что, по мнению большинства исследователей, кооперативные взаимодействия между субъединицами глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы играют первостепенное значение в осуществлении каталитического акта, точнее в регуляции последовательного протекания различных его стадий на двух активных центрах «функционального димера» [23]. Эта концепция хорошо согласуется с предположением об отсутствии каталитической активности у отдельных субъединиц дегидрогеназ (эксперименты по диссоциации и инактивации дегидрогеназ в растворе [2]). Так как в наших работах было доказано, что мономерные формы глицеральдегид-3-фосфатдегид-рогеназы столь же эффективно катализируют реакцию, как и

89

тетрамеры, то роль объединения субъединиц и существование кооперативных взаимодействий между ними становились непонятными. Нами было высказано предположение, что различия между каталитической эффективностью иммобилизованных мономеров и тетрамеров нивелируются при определении их активности в искусственных условиях при концентрациях субстратов, близких к насыщающим. При недостатке какого-либо из субстратов или кофакторов эти различия могут быть более выражены. Наиболее вероятно, что именно изменение концентрации кофактора, для связывания которого характерна кооперативность, должно играть решающую роль в изменении каталитических свойств иммобилизованных мономеров и тетрамеров. Для глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из дрожжей нам не удалось обнаружить различий между иммобилизованными мономерами и тетрамерами в величинах Vmax и Кт для 3-фосфоглицеринового альдегида и НАД. Значения этих параметров были равны соответственно 50 мкмоль/мин на 1 мг белка, 0,20±0,2 мМ и 0,05±0,01 мМ. Однако такое определение активности не позволяет выяснить, как ведет себя фермент при очень низких концентрациях кофактора, поскольку в используемой системе последний не подвергается регенерации. Применив для регенерации кофактора систему, содержавшую лактатдегидрогеназу, пируват и НАДН, нам удалось измерить активность мономеров и тетрамеров глицеральдегид-3-фос-

фатдегидрогеназы при концентрациях НАДН от 0,6 до 60 мкМ [24]. Для проведения эксперимента иммобилизованные формы гли-церальдегид -3 - фосфатдегидроге-. назы смешивали с иммобилизованной отдельно на сефароэе лактатдегидрогеназой,