используют в основном два метода: гидродинамический анализ детергентных экстрактов мембран и метод молекулярных мишеней, который дает возможность изучать нативную структуру комплекса в мембране.

Молекулярная масса и субъединичная структура Л-белка

В настоящее время наиболее подробно охарактеризованы молекулярная масса регуляторного А/-белка. Данные, полученные с использованием трех методов идентификации ЛЧэелка, дают похожие результаты. Так, Пфейффер с помощью [3Н] Р3-(4-азидо-анилид) Р'-ГТФ при блокировании мембранных белков эритроцитов голубя показал включение метки в полипептиды с молекулярной массой 86 000, 53 000, 42 000 и 23 000 дальтон [6]. Из них только полипептид с молекулярной массой 42 000 дальтон был связан с аденилатциклазной активностью в детергентном экстракте при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Этот полипептид, проявляющий биологическую активность регуляторного белка в экспериментах по реконструкции, можно было отделить от аденилатциклазы на аффинном носителе, содержащем •ГТФ [6, 7]. Примерно в то же время был обнаружен катализируемый субъединицей Ау холерного токсина перенос [32Р] АДФ-ри-бозы от [з2Р] НАД+ на мембранный белок, который при денатурирующем электрофорезе дает меченый полипептид с молекулярной массой 42 000—45 000 дальтон [11, 24—27].

В ряде работ была доказана идентичность этого АДФ-рибо-зилируемого полипептида и полипептида, сорбирующегося на ГТФ-содержащих носителях и восстанавливающего чувствительность каталитического компонента аденилатциклазы к гуанило-вым нуклеотидам и фториду [13, 16, 24, 26, 28]. Затем в мембранах клеток лимфомы 549, клеток крысиной гепатомы, в фибробла-стах легких, а также в тимусе было обнаружено специфическое включение метки в присутствии холерного токсина в полипептид •с молекулярной массой 52 000 дальтон [11, 26, 29], который по «биологической функции был похож на полипептид с молекулярной массой 42 000 дальтон [29].

При очистке Af-белка из печени кролика [14] и эритроцитов индюка [15], осуществленной в лаборатории Джилмана, биоло-

гическую активность Af-белка проверяли по реконструкции регулируемой аденилатциклазы с мембранами клеток сует, содержащими каталитический компонент аденилатциклазы. Полученный высокогомогенный N-белок из печени кролика состоял из трех полипептидных цепей с молекулярной массой 52 000, 45 000 и 35 000 дальтон, а N-белок эритроцитов — из двух полипептидов массой 45 000 и 35 000 дальтон. Молекулярная масса неденатури-рованного Л'-белка, не подвергавшегося действию активаторов, при гидродинамическом измерении равнялась 70 000 и 81 000 дальтон соответственно. Если же гидродинамическое определение массы М-белка проводилось в неочищенных детергентных экстрактах, то, по данным ряда авторов, она равнялась 126 000—130 000 дальтон [16, 17]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Л/-белок является мультисубъединичным олигомером, у которого еще не установлены количество и численное соотношение субъединиц.

По-видимому, биологическую функцию эффекторного белка аденилатциклазы выполняют полипептиды с молекулярной массой как 42 000—45 000, так и 52 000 дальтон. Это следует из наличия реконструктивной активности у фракций очищенного JV-белка из печени кролика, обогащенных первым или вторым полипептидами [14]. Кроме того, биологической активностью обладают суммарные фракции N-белка из тех мембран, в которых при АДФ-рибо-зилировании метка включается или в полипептид с массой 45 000 дальтон [16, 28], или в полипептид с массой 52 000 дальтон [26, 29]. Для обоих полипептидов не было обнаружено существенных различий в способности активироваться под воздействием фторида или гуанозин-5'-(Р3-тиотрифосфата) (ГТФ yS) [14]. Они одинаково хорошо подвергались АДФ-рибозилированию под воздействием холерного токсина [30]. Их пептидные карты существенно перекрываются [31]. Коопер с сотр. сделали предположение о том, что модулируемые ГТФ регуляторные белки, в том числе и N-белок, содержат одинаковые домены, узнающие холерный токсин, а процесс АДФ-рибозилирования изменяет характер их взаимодействия с гуаниловыми нуклеотидами [32]. Нортрап с сотр. считают, что биологическая функция полипептида с массой 35 00Q дальтон [14, 15] заключается в ингибировании активности поли--пептидов с массой 45000 и 52 000 дальтон и что для активации Л'-белка необходима диссоциация составляющих его субъединиц [33].

Молекулярная масса рецепторов и их взаимодействие с \-белком

Наиболее изученный из рецепторных белков, связанных с аденил-атциклазой, — р-адренергический — имеет, по-видимому, также олигомерное строение. Молекулярная масса полипептидов из мембран крысиных миобластов [34] и эритроцитов индюка [35] составляет 32 000—41 000 дальтон, что меньше массы нативного ре-

4 Заказ 423

97

цепторного белка эритроцитов индюка (90 000 дальтон)" [36] и клеток лимфомы S49 (72 ООО дальтон) [4].

Весьма важным является тот факт, что определяемая молекулярная масса р-рецептора существенно зависит от типа связанного с ним лиганда. В эритроцитах лягушки [37] он увеличивается в том случае, если мембраны перед солюбилизацией обрабатывают агонистом. В присутствии антагониста или в отсутствие лиганда увеличения молекулярной массы р-рецептора не происходит. Индуцированные агонистом изменения рецептора не объяс-* няются образованием комплекса R—С2 [3]. Лимбирд с сотр. показали, что связанный с меченым агонистом рецептор ретикуло-цитов крыс при гель-фильтрации элюируется вместе с [32Р] АДФ рибозилированным М-белком аденилатциклазного комплекса [12]. Таким образом, агонист способствует физическому сопряжению ¦р-рецептора с TV-белком и комплекс Н—R—N существует более или менее длительное время, достаточное для его обнаружения: Это явление распространяется, по крайней мере, на глюкагоновый рецептор печени крыс [38, 39] и на а-адренергический рецептор тромбоцитов [40].

Молекулярная масса каталитического белка и взаимодействие его с Л -белком

N-бёлок образует более или менее прочные комплексы с каталитической субъединицей. Об этом свидетельствуют накопленные к настоящему времени многочисленные данные, в том числе и весьма противоречивые сведения о молекулярных размерах каталитического белка аденилатциклазы.

Каталитический белок отдельно от N-белка по принятой многими ведущими исследователями концепции нестабилен и может использовать только нефизиологический субстрат Мп2+-АТФ. Мд2+-АТФ-зависимая активность у эукариотической аденилатциклазы присуща функциональному комплексу C=N [8, 22, 41, 42].

Показано, что Мп2+-АТФ является физиологическим субстратом лишь для аденилатциклаз низших эукариот и прокариот [43— 45], а также для цитоплазматической аденилатциклазы семенников, не чувствительной к гуаниловым нуклеотидам и представляющей собой, по всей видимости, индивидуальный каталитический белок [46, 47]. При солюбилизации плазматических мембран некоторых эукариотических клеток увеличивается способность солю-билизированного фермента к использованию Мп2+ и уменьшается чувствительность к регуляции гуаниловыми нукл