т феномен был показан и при измерении гидродинамических характеристик высокогомогенного N-белка. После активации эффекторами молекулярная масса Л/-белка из печени кролика уменьшалась от 70 000 до 50 000 дальтон [14], а /V-белка из эритроцитов индюка — от 81000 до 50 000 дальтон [15]. Эти факты могут указывать либо на диссоциацию //-белка на субъединицы в результате действия лигандов-эффекторов, либо на конформационный переход с аномальным изменением в результате этого кажущейся молекулярной массы. Предварительные данные об ингибирующей функции, выполняемой в N-белке полипептидом с массой 35000 дальтон [33], могут свидетельствовать в пользу первого предположения; они дали исследователям возможность сделать вывод о том, что активация полипептида с массой 45 000 дальтон происходит после отделения от нее ингибирующего полипептида с массой 35 000 дальтон.

Индуцированные гуаниловыми нуклеотидами изменения физического состояния /V-белка эритроцитов голубя обнаруживали также по изменению характера протеолиза трипсином 32Р АДФ-рибозилированного мембранносвязанного /V-белка [ПО]. Эти изменения выражались в уменьшении прочности связи протеолитиче-ских фрагментов с мембранами и появлении вместо нескольких минорных фрагментов крупного полипептида с молекулярной массой 41 000 дальтон. Они происходили также в мембранах эритроцитов человека, в которых рецептор и каталитический белок практически отсутствуют, а значит, не были связаны с белок-белковым

106

\

взаимодействием между рецептором и TV-белком, N-белком и каталитическим белком.

Взаимодействуя с N-белком, гуаниловые нуклеотиды, фторид и ионы магния вызывают прочную ассоциацию N-белка с каталитическим белком, что также свидетельствует об изменении физического состояния N-белка. Так, методом молекулярных мишеней было показано, что в мембранах эритроцитов индюка в присутствии фторида или GppNHp, а также Mg2+ размер аденилатциклазной мишени увеличивается на 130 000 дальтон [36]. Эти же эффекторы в присутствии Mg2+ могут стабилизировать взаимодействие N-белка с акцепторными мембранными препаратами аденилатциклазы из клеток сус~ и UN С в процессе реконструкции [111— 113] и взаимодействие его с солюбилизированным каталитическим белком, что отражается в увеличении размера аденилатциклазного комплекса, определяемого гель-фильтрацией и центрифугированием в градиенте плотности сахарозы [28, 51, 57, 58].

Характерной чертой активации N-белка является наличие медленной стадии, которая проявляется в виде лаг-периодов на графиках накопления продукта реакции. Исследователи, пытаясь установить природу медленной кинетики, приходят к заключению, что основной вклад в нее вносят медленные изменения конформацни N-белка или способа взаимодействия его субъединиц. Так, работы, проведенные в лабораториях Джилмана [14, 15], Шрам-ма [88], Нир [10] и других, показали, что активация индивидуальных фракций N-белка гуаниловыми нуклеотидами или фторидом растянута во времени на десятки минут. В ходе реконструкции с каталитическим белком лимитирующей стадией является как раз активация N-белка, а не процесс взаимодействия N-белка с каталитическим или следующие за этим конформационные изменения каталитического белка [10, 88, 113]. Исходя из такого предположения, Бирнбаумер считает [114], что аденилатциклазу можно отнести к гистерезисным ферментам [115]. Однако возможно, что и другие медленные процессы, такие, как вытеснение эндогенного ГДФ из комплекса с N-белком в эритроцитах индюка [95, 109], тоже имеют значение для возникновения лаг-периодов. Здесь следует отметить, что медленная стадия обычно находится под контролем гормона [92—95, 107, 116, 117] и ионов Mg2+ [118]. В определенных условиях она появляется при активации .фермента под действием ГТФ [118]. Длительность лаг-периода может зависеть от химического строения активирующего нуклеотида [56, 119].

Регуляторный и активный центры аденилатциклазного комплекса

Центры связывания эффекторов на V-белке

В 1982 г. появилось сообщение из лаборатории Джилмана [33] о прямом исследовании нуклеотид-связывающего регуляторного центра N-белка. Значение этого события можно оценить, если

107

/

принять во внимание, что до сих пор о наличии этого центра свидетельствовали лишь сродство неочищенных фракций /V-белка к аффинным ГТФ-содержащим носителям и способность элюиро-ваться с этих носителей другими гуаниловыми нуклеотидами [6, 7, 116], а также ковалентное включение [3Н]Р3-(4-азидоанилид)Р1-ГТФ в Л/-белок мембран эритроцитов голубя [75].

Однако непосредственное изучение регуляторного участка неочищенного TV-белка по взаимодействию с ним меченых нуклеотидов было связано с методическими трудностями. Только около 1—5% мест связывания [3Н] GppNHp в плазматических мембранах являются специфическими по отношению к аденилатциклазной системе [6, 66, 105]. Взаимодействующую с /V-белком фракцию [3Н] GppNHp удавалось вычленить лишь в мембранах эритроцитов, вытесняя меченый нуклеотид изопротеренолом в присутствии ГТФ [105], и в мембранах из сердца собаки, где неспецифически связанные нуклеотиды высвобождались после обработки мембран аденилил-5-имидодифосфатом в присутствии пропранолола, ЭДТА и GppNHp [120].

При изучении активации высокогомогенного /V-белка, которая происходила параллельно связыванию [358]ГТФу8, удалось обнаружить только один класс связывающих участков [33]. Их концентрация равнялась 0,34 моль на моль /V-белка. Учет возможной денатурации /V-белка позволил исследователям сделать заключение о том, что одна молекула /V-белка содержит один нуклеотид-связывающий центр. Использование меченого по фосфору азида ГТФ ([y32P]-8-N3 ГТФ) позволило прямо показать, что нуклеотид-связывающий центр расположен на субъединицах с молекулярной массой 45 ООО и 52 ООО дельтон, но не на полипептиде с молекулярной массой 35000.

По конкуренции различных нуклеотидов с [355]ГТФу8 за регуляторный центр установлен порядок сродства нуклеотидов: ГТФ yS>ГТФ > GppNHp> ГДФ >8-Ы3ГТФ»ИТФ>ГМФ.

Эти данные, полученные на высокогомогенном /V-белке, довольно хорошо соответствуют данным о порядке сродства нуклеотидов к малоочищенным препаратам /V-белка. Они получены косвенными способами по конкуренции за активацию аденилатциклазы неактивирующих нуклеотидов с активирующими [69, 72, 121], по конкуренции нуклеотидов со специфически связанной с /V-белком фракцией [3Н] GppNHp [120] и по эффективности элюции TV-белка с ГТФ-содержащего носителя различными нуклеотидами [28].

Кроме центра связывания гуаниловых нуклеотидов /V-белок содержит также участок, подвергающийся АДФ-рибозилированию. По аналогии со строением небелковых и некоторых белковых субстратов, способных участвовать в реакции АДФ-рибозилирования ¦[122], а также по ингибированию реакции АДФ-рибозилирования /V-белка метиловым эфиром L-аргинина [123] можно предполагать, что этот участок содержит остатки аргинина. Несомненным является тот факт, что два вышеуказанных участка различны, хотя и находятся на одной и той же субъединице /V-белка

108

\

[32]. Об этом свидетельствуют нали