чие сродства к ГТФ-содержа-гдим носителям у АДФ-рибозилированного /V-белка [24, 27], а также возможность включения АДФ-рибозы в полипептиды 42 ООО •и 47 ООО дальтон из печени крыс после связывания с ними [3Н]GppNHp [123]. Однако точная локализация этого участка не известна.

Отсутствуют сведения также о расположении катионных локусов /V-белка, чувствительных к нефизиологическому активатору, «фтор-аниону [124]. В ранних работах на основании различий активации аденилатциклазы под действием GppNHp и NaF в чувствительности к трипсину и по другим непрямым критериям заключали, что эти виды активации связаны с различными белками [8, 64]. Однако поздние многочисленные работы [6, 7, 24, 125— 127] свидетельствовали о том, что действие фторида направлено именно на N-белок. Это мнение получило окончательное подтверждение в результате экспериментов по реконструкции, где использовались мембранные препараты N-белка, лишенные каталитического белка [125, 126], или высокогомогенные препараты N-белка, яолученные из холатных экстрактов [14, 15]. Кроме того, было показано, что фторидная стимуляция не определяется рецептором, так как она имеет место в клетках UN С, в которых нарушено сопряжение рецептора с N-белком [50]. По данным реконструкции каталитический белок также имеет значение для фторидной стимуляции [8, 111].

В последнее время обсуждается роль Mg2+ в активации аденилатциклазы. Действие Mg2+ направлено как на рецептор (перевод рецептора в состояние высокого сродства к агонистам), так и на каталитический белок (увеличение максимальной скорости аденилатциклазной реакции). Для осуществления действия Mg2+ абсолютным требованием является наличие в аденилатциклазной системе N-белка [50, 65, 111, 128].

Отсюда следует, что на N-белке должен быть расположен участок связывания свободного Mg2+. И в самом деле, в лаборатории Бирнбаумера [113, 118] показана регулирующая роль ионов Mg2+, которые ускоряли процесс активации фракции N-белка гуа-ниловыми нуклеотидами и фторидом. Известно также, что удаление Mg2+ из мембран с помощью высоких концентраций ЭДТА вызывает высвобождение связанных гуаниловых нуклеотидов и предотвращает активацию аденилатциклазы под действием GppNHp [104, 129]. Участок связывания двухвалентных катионов изучался и на высокогомогенном N-белке [33]. При этом было показано, что Mg2+ абсолютно необходим для поддержания активированного состояния N-белка. Авторы полагают, что двухвалентные катионы могут регулировать медленную диссоциацию субъединиц N-белка. В этой работе показано также, что процессы активации — инактивации чувствительны также к Мп2+, Са2+, Ва2+ и Sr2+, т. е. что участок связывания двухвалентных металлов не имеет абсолютной специфичности к катионам. Однако одновалентные катионы Na+, К+, NH4+ эффекта не вызывали.

109

Механизм активации /V-белка и строение центра связывания гуаниловых нуклеотидов

Термин «активация N-белка» стал упоминаться в литературе с развитием работ по кинетике реконструкции фракций, содержащих отдельно /V-белок и каталитический белок [10, 14, 15, 88, 113, 118, 125, 126, 130]. Его следует понимать как изменения А/-белка, необходимые для перевода каталитического белка аденилатциклазы в высокоактивное состояние.

Молекулярные события, приводящие к активации YV-белка, связаны в первую очередь с функционированием ГТФ-связываю-щего центра, расположенного на субъединице 42 000 или 52 000' дальтон.

В исследованиях, проводимых на аденилатциклазе, почти не изученными являются два вопроса: каково строение центра связывания гуаниловых нуклеотидов и какие особенности химической структуры нуклеотидов являются необходимыми и достаточными для активации?

Разрешение этих вопросов позволило бы с помощью аналогов нуклеотидов направленно изменять регуляторные свойства N-белка. До сих пор изучение характеристик топографии регуляторного центра проводилось в основном лишь косвенными методами.

Тем не менее некоторые заключения на основании имеющихся данных сделать можно. Так, Шпигель с сотр. [7] показали, что ГТФ-агароза не обладает сродством к ГТФ-связывающим белкам аденилатциклазного комплекса в том случае, если ГТФ «пришит» через рибозу, но является хорошим аффинным сорбентом, если ГТФ «пришит» через у-фосфат. Эти данные свидетельствуют о значительном вкладе кольца рибозы в сродство нуклеотида к ре-гуляторному участку. И в то же время небольшие изменения в. рибозной части молекулы З'-дезокси-ГТФ не мешают активации аденилатциклазы и даже усиливают ее [131]. Интересно, что активирующие свойства ГТФ сохраняются и в некоторых случаях усиливаются при таких модификациях у-фосфата, которые не затрагивают гидроксильной группы. К таким соединениям относятся р-фенилендиамин-ГТФ [7], гуанозин-5'-тетрафосфат [132], ГТФу& [33, 116], Р3-(4-азидоанилид)Р1-ГТФ и Р3-(Ы-(аминоэтил)-1-наф-тиламин-8-сульфонат)Р,-ГТФ [133]. В то же время прямое изучение ГТФ-связывающего центра гомогенного yV-белка показало, что сродство к нему нуклеотидов уменьшается в ряду ГТФ> ГДФ> >ГМФ, т. е. число зарядов в фосфатном участке молекулы нуклеотида также имеет определенное значение для сродства [33].

В пользу высокого сродства регуляторного участка А/-белка к азотистому основанию свидетельствует отсутствие активирующего действия в отличие от ГТФ, у ЦТФ, УТФ и 2-аминопурин-рибозидтрифосфата [116]. Прямым методом показано также, что ИТФ имеет к регуляторному центру меньшее сродство, чем ГДФ [33]. По-видимому, положения 2 и 6 пуринового основания особенно значимы для сохранения сродства, так как введение по-

110

\

этим положениям заместителей в молекуле GppNHp значительно уменьшает активирующие свойства нуклеотида и его способность связываться с плазматическими мембранами эритроцитов [133].

Установлено пока одно условие, достаточное для выполнения нуклеотид-связывающим центром активирующей функции. Оно заключается в присутствии у-фосфата в молекуле гуанилового нуклеотида. Причем механизм активации не предполагает использование этого фосфата для фосфорилирования или пирофосфори-лирования, так как нуклеотиды с негидролизуемыми р-у- и у-р-свя-зями не только не вызывают меньшего по сравнению с ГТФ активирующего эффекта, но, наоборот, активируют аденилатциклазу в несколько раз лучше, чем ГТФ. ГДФ имеет хотя и меньшее сродство к регуляторному центру /V-белка, чем ГТФ, GppNHp или ГТФуБ [33], однако вполне достаточное для довольно прочного связывания нуклеотида. При этом ГДФ в большинстве аде-^ нилатциклазных систем ингибирует стимуляцию аденилатциклазы с помощью GppNHp [92, 93, 134] или катехоламинов [135]. ГДФ, в отличие от ГТФуБ, не вызывает активированного состояния у гомогенного /V-белка [14, 15] ив процессе реконструкции частично очищенного /V-белка с каталитическим белком не вызывает активации сам [125] и останавливает активацию, происходящую под действием GppNHp [136]. Гуанозин-5'-(а, р-метилен) дифосфат (СрСНгр) ингибирует базальную и стимулируемую аденилатци-клазную активность в мембранах печени крыс [137]. ГДФ и ГДФрБ, в отличие от нуклеозидтрифосфатов, препятствуют ассоциа