снованию и наибольший ингибирующий эффект дают модифицированные по ри-бозе аналоги аденозина. Р-участок легко отличить от мембран-носвязанного аденозинового рецептора, который активируется или ингибируется меньшими концентрациями аденозина, специфичен JK рибозе и ингибируется метилксантинами. Ингибирование аденилатциклазы через Р-участок обнаружено в подавляющем большинстве исследованных аденилатциклазных систем [149]. Он отличен от активного центра аденилатциклазы, так как 9-(тетрагид-ро-2-фурил) аденин [150, 151] и 2',5'-дидезоксиаденозин [151] и аденозин [152] ингибируют аденилатциклазу неконкурентно по отношению к Mg2+-AT. Однако он не имеет отношения и к /V-бел-ку. Об этом свидетельствуют данные, полученные на эритроцитах индюка, где 2',5'-дидезоксиаденозин не влияет ни на обмен нуклеотидов в регуляторной центре /V-белка, ни на взаимодействие с /V-белком, но вызывает быстрое ингибирование аденилатциклазы, предварительно активированной GppNHp [109]. В гибридных клетках NG 108-15 2'-дезоксиаденозин также быстро ингибирует аденилатциклазу в мембранах, предварительно обработанных GppNHp, однако эффект аналога аденозина обратим и активация фермента полностью восстанавливается после удаления нуклеозида из мембран отмывкой [153]. Вышеперечисленные данные могут свидетельствовать в пользу расположения Р-участка на каталитическом белке, однако прямо это не показано. Ингибирующий эффект аналогов аденозина может заключаться в том, что они препятствуют реализации активирующего действия /V-белка на уровне его взаимодействия с каталитическим белком или на уровне активации каталитического белка. Следует также отметить, что ингибирование аденилатциклазы через Р-участок контролируется ионами Mg2+ и Мп2+ [149, 150, 152].

Физические свойства каталитического белка аденилатциклазы практически не- изучены. Причиной отсутствия информации являются существенные потери каталитического белка, не связанного с /V-белком, происходящие в процессе его очистки в результате инактивации [61]. Наиболее правильное представление о характеристиках каталитического белка можно получить, изучая биологические препараты, функционально лишенные YV-белка. К ним относятся линия клеток лимфомы S49, сус~ [115, 123], цитозоль-ные фракции семенников крыс [22, 47], а также растворимые аденилатциклазы низших организмов [43—45]. Как уже упоминалось выше, общим свойством для этих белков является сильное увеличение активности в присутствии ионов Мп2+, но не Mg2+. Определяется ли это обстоятельство свойствами связывающего ионы двухвалентных металлов аллостерического центра или раз-

114

¦ям

личием в сродстве к активному центру Mg-АТФ2- и Мп-АТФ2-„ не известно. В случае клеток сус~ было, например, показано, что-Кт для обоих субстратов одинакова и составляет 0,1—0,2 мМ [148]. В луброльных экстрактах плазматических мембран клеток сус- Мп2+-зависимая активность аденилатциклазы чувствительна: к некоторым протеазам и сульфгидрильным препаратам [115, 123].

Активный центр каталитического белка

Изучению активного центра аденилатциклазы посвящено относительно небольшое количество работ. С одной стороны, это обстоятельство связано с отсутствием методов получения стабильных гомогенных препаратов каталитического белка из тканей млекопитающих. С другой стороны, слабое развитие этого направления исследований в течение ряда лет определялось общей направленностью усилий экспериментаторов на разрешение вопросов регуляции аденилатциклазного комплекса.

В данном разделе будут обобщены разрозненные сведения, которые позволяют сделать некоторые выводы о строении активного центра аденилатциклазы.

Большинство из этих данных получено благодаря применению структурных аналогов субстрата реакции — АТФ. Использование аналогов субстрата расширяет методические возможности изучения механизмов каталитических реакций негомогенных ферментов.

К альтернативным субстратам аденилатциклазы относятся: 2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат [154, 155], аденилил-5'-имидоди-фосфат [72], аденозин-5'-(Р3-тиотрифосфат) [156], аденозин-5'-(Р'-тиотрифосфат) [157], аденин-арабинонуклеозид-б'-трифосфат [158], туберцидин-5'-трифосфат [159] и формицин-5'-трифосфат [159, 160]. При сравнении их структуры обнаруживается, что субстратная специфичность ограничена, как правило, адениновым основанием. На сродстве субстрата к ферменту не отражается модификация пятичленного кольца гетероциклического основания в положениях 8 и 9, переводящая адениновое основание в фор-мициновое [160]. Слабое ингибирование аденилатциклазы, свидетельствующее о низком сродстве к активному центру пиримиди-нового кольца, показано для пиримидиновых нуклеозид-5'-три-фосфатов (ТТФ, ЦТФ, «ЯТФ и УТФ) [161].

- Таким образом, важность вклада гетероциклического основания в сродство АТФ к активному центру аденилатциклазы не подлежит сомнению. Однако детерминанты этого сродства известны-лишь приблизительно. Роль такой детерминанты, возможно, выполняет аминогруппа аденина, расположенная в положении 6. Возможно, что она отвечает за взаимодействие с сульфгидриль-ной группой, о существовании которой свидетельствует чувствительность каталитического компонента аденилатциклазы из клеток сусг к сульфгидрильным ядам [115, 123].

Особый интерес представляет характеристика взаимодействия с ферментом трифосфатного участка субстрата. Во-первых, этот

115

участок несет в себе группу, подвергающуюся нуклеофильной атаке во время каталитического акта (ex-фосфат), и одновременно пирофосфатную группу, отщепляющуюся в результате катализируемой реакции. Во-вторых, именно с поликатионным фосфатным участком связывается ион двухвалентного металла, без которого невозможна работа аденилатциклазы.

К настоящему времени изучено действие на аденилатциклазу нескольких аналогов АТФ, имеющих модификации по трифосфат-ной цепи. Аденозин-5'-(а,В-метилен)трифосфат и аденозин-5'-(Р1-тиотрифосфат) обладают таким же сродством к ферменту, как и АТФ [148, 150]. В то же время показано, что аденозин-5'-(а,В-метилен)тетрафосфат (АрСН2ррр) является более сильным, а аде-нозин-5'-(а,р-метилен)дифосфат (ЛрСН2р) — более слабым ингибитором, чем аденозин-5'-(а,В-метилен)трифосфат (АрСН2рр) [150], а сродство к ферменту аналогов, содержащих серу, уменьшается в следующем порядке: аденозин-5'-(Р'-тиотрифосфат) > >аденозин-5'-(Р1-тиодифосфат) > аденозин-5'-(Р1-тиомонофосфат)' {148]. Изменение сродства ингибиторов в данных случаях происходило, очевидно, только благодаря изменению числа фосфатных групп.

Так как введение метиленового мостика вместо кислородного в молекуле АТФ не влияет на заряд или общую длину полифосфатной цепи [57], можно считать, что вышерассмотренные примеры свидетельствуют об определенной роли фосфатного участка в связывании субстрата аденилатциклазой. Это заключение подтверждается также меньшим сродством к аденилатциклазе продукта реакции — цАМФ — по сравнению с субстратом [162].

Совершенно не исследованным является вопрос о реальной конформации субстрата в активном центре аденилатциклазы. Не известна ориентация основания отн