в ней, помимо белка с исходным молекулярным весом 90000, еще двух с молекулярными весами 45000 и 180000. Эти данные указывают на возможность перехода одних молекулярных форм в другие. Смещением равновесия между олигомерными формами НАД-киназы можно объяснить и описанные" выше различия в профилях элюции фермента в разных препаратах.

Результаты, полученные при электрофоретической исследовании и гель-фильтрации НАД-киназы из сердца голубя, указывают на то, что частично очищенные препараты фермента, как и в случае НАД-киназы из скелетных мышц кролика, содер-

Рис. 1. Кривая элюирования белка и выход НАД-киназы при гель-фильтрации через колонку с сефадексоы G-200 двух ферментных препаратов (I и II) из сердца голубя.

По оси абсцисс — объем выхода фракции, по оси ординат: левая шкала — Л2во, правая — активность; стрелками указан молекулярный вес фракций; сплошная линия — белок, прерывистая — ак--тивность

жат несколько белковых фракций, различающихся по молекулярному весу и проявляющих каталитическую активность, которые можно рассматривать как в разной степени ассоциированные олигомеры фермента.

В противоположность частично очищенному препарату гомогенная по данным электрофореза НАД-киназа из сердца голубя утрачивает способность к ассоциации — диссоциации. При гель-фильтрации такого-препарата через колонку с сефарозой 6В НАД-

13»

киназа элюируется в виде одной фракции с молекулярным весом 45 000. Высокомолекулярные формы исчезают, в том числе и форма с молекулярным весом 180000, которая нередко преобладала в частично очищенных препаратах фермента (см. рис. 1).

При электрофорезе в однородном геле очищенный фермент давал одну полосу, что указывало на его гомогенность. Молекулярный вес субъединицы, определенный в присутствии додецил-сульфата натрия, оказался также равным 45 000. Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе ионообменной хроматографии разрушается четвертичная структура фермента, и в разной степени ассоциированные олигомеры распадаются на субъединицы.

В частично очищенных препаратах НАД-киназы из печени кролика также обнаружено несколько молекулярных форм фермента [6]. Электрофоретическое разделение в однородном и градиентном гелях с последующим выявлением места локализации НАД-киназы тетразолиевым .методом и элюцией фермента из отдельных участков столбика геля позволило выявить до 7 полос белка, проявляющих ферментативную активность. Молекулярные веса этих белковых зон оказались равными 650000, 400 000,, 380 000—370 000, 300000—280000, 230000—210 000, 200000, 180000. В определенных условиях удавалось наблюдать переходы между формами.

При выделении НАД-киназы из печени кролика в качестве последней стадии очистки использовали также ионообменную хроматографию на ДЭАЭ сефадексе А-25. В отличие от НАД-киназы из сердца голубя, которая после ионообменной хроматографии утрачивала четвертичную структуру и была представлена только одной формой — мономером, фракционирование на ионооб-меннике НАД-киназы из печени кролика не сопровождалось разрушением четвертичной структуры. На этой стадии очистки было получено несколько электрофоретически гомогенных олигомеров с молекулярными весами 280000—290000, 180000 и 150 000— 160000, 210000—220000 [17]. Как правило, все препараты фермента содержали форму с молекулярным весом 180 000—190000. Число форм в разных препаратах, получаемых после ионообменной хроматографии, могло варьировать. Никогда не наблюдали присутствия всех форм в одном препарате одновременно. Всего было исследовано 40 препаратов НАД-киназы.

На основании анализа гомогенных препаратов фермента было сделано заключение о существовании в печени кролика двух типов НАД-киназы: относительно низкоактивного фермента, в формировании четвертичной структуры которого участвуют однородные субъединицы с Мг 33 000 (а-тип), и высокоактивного фермента, олигомеры которого построены из субъединиц с Мг 62 000 (р-тип). Каждый из* указанных типов фермента может существовать в виде олигомерных форм разной степени ассоциации. В таблице 1 представлены результаты, полученные при определении молекулярных весов и удельной активности а- и р-типов НАД-киназы из печени кролика. Фермент а-типа постоянно присутствует

140

Таблица 1

Молекулярный вес н удельная активность олигомеров НАД-кииазы а- и 6-типов (17)*

Количество

Форма (Мг) Удельная актив- Тнп Молекулярный препаратов.

ность, ед./мг субъединиц вес субъединиц содержащих

данную форму

280 000—290 000 130 Р 62 000 4

280 000—290 000 20—30 а 33000 7

210 000—220 000 160 Р 62 000 И

180000—190 000 10—20 а 33000 40

150 000—160 000 3—6 а 33000 16

в печени кролика, тогда как фермент р-типа обнаруживается нь я каждом препарате (в 15 из 40 препаратов). В процентном отношении доля высокоактивных форм фермента по белку меньше, а ло активности больше, чем доля малоактивных форм. Так, в раз-дых препаратах на долю р-формы НАД-киназы приходится от ¦66 до 80% общей активности и всего 15—20% ферментного белка, тогда как в случае а-НАД-киназы наблюдается обратное соотношение: на ее долю приходится 15—20% общей активности и 60— .70% белка ферментного препарата.

Выше было указано, что молекулярный вес субъединицы НАД-киназы из скелетных мышц кролика равен 31 000. Близкие ло значению Мг субъединицы определены для фермента из печени крысы (35 000) и голубя (34 000), а также из дрожжей Saccho.ro-myces cerevisiae (31000) и Candida utilis (32 000) [18, 19, 20, 10].

Основываясь на близких значениях молекулярных весов субъ-¦единицы а-НАД-киназы и фермента из вышеуказанных объектов, можно считать, что фермент а-типа из печени кролика подобен ¦ферментам из других источников. Что касается р-НАД-киназы, то этот тип фермента обнаружен пока только в печени кролика.

Сравнительное изучение а- и р-типов НАД-киназы из печени кролика показало, что эти два типа фермента различаются по тиногим свойствам. Помимо описанных выше различий в субъединичном составе и удельной активности можно указать на разный характер взаимодействия двух типов фермента с ионообменником, на некоторые различия кинетических свойств и др.

Несмотря на то что из печени кролика можно выделить пять гомогенных форм фермента, а из сердца голубя только одну, общим свойством для фермента из обоих источников является то, •что его гомогенные молекулярные формы не способны к ассоциации или диссоциации и представляют собой как бы застывшие, десенсибилизированные формы.

Весь изложенный выше материал убедительно свидетельствует ¦о существовании НАД-киназ в скелетных мышцах кролика, сердце голубя и печени кролика в виде различающихся по молекулярному весу олигомеров, способных к взаимным переходам. Олиго-

141

меры фермента из скелетных мышц кролика, сердца голубя, а- и Р-типов НАД-киназы из печени кролика формируются из различного числа идентичных субъединиц с Мг 31000, 45000, 33 000 и 62 000 соответственно. Способность к ассоциации — диссоциации утрачивается после очистки фермента на ионообм