Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

еннике. В дальнейшем изложении мы обсудим возможную причину влияния, ионообменной хроматографии на четвертичную структуру фермента.

Кинетические свойства НАД-киназы

Смещение равновесия между олигомерными формами фермента может обеспечить быструю и тонкую регуляцию активности фермента в том случае, когда эти формы сильно различаются по каталитической активности или когда одна или несколько форм вообще неактивны [21]. Поэтому самым характерным свойством-диссоциирующих ферментных систем является зависимость удельной активности от концентрации фермента. Эта зависимость обусловлена переходами между олигомерами разной степени ассоциации, различающимися по каталитической активности. Большое число примеров диссоциирующих ферментов и подробный анализ их свойств приведены в монографии Б. И. Курганова [21]. Демонстрация зависимости а от [Е]„ может служить убедительным доказательством принадлежности фермента к классу диссоциирующих ферментных систем. При этом с повышением концентрации белка можно наблюдать либо повышение, либо понижение удельной активности в зависимости от того, какая форма данного фермента, ассоциированная или диссоциированная, обладает более высокой ферментативной активностью [21].

Зависимостью а от [Е]0-характеризовались препараты НАД-киназы из скелетных мышц кролика (рис. 2). Принимая во внимание то обстоятельство, что активность определяли в растворе, в условиях, при которых нельзя исключить взаимного перехода молекулярных форм, не представляется возможным судить об удельной активности каждой из них. Тем не менее форма кривой, представленной на рис. 2 А, позволяет констатировать, что наиболее диссоциированные и наиболее ассоциированные в данных условиях формы фермента (левая и правая ветви кривой) способны осуществлять синтез НАДФ с заметно большей скоростью, чем промежуточные формы. Форма кривой а от [Е]„ упрощалась, если ферментный препарат подвергался многократному замораживанию и оттаиванию в процессе его хранения. Изменение концентрации субстрата в среде инкубации также изменяло форму кривой а от [Е]0, что могло быть обусловлено его влиянием на равновесие между олигомерными формами белка [22].

Зависимость удельной активности от концентрации фермента демонстрировали также частично очищенные препараты НАД-киназы из сердца голубя (рис. 2 Б, кривая /). Подобно ферменту из скелетных мышц кролика НАД-киназа из сердца голубя про-

142

являла более высокую активность при низком содержании белка в инкубационной пробе. С повышением содержания белка активность фермента постепенно понижалась и выходила на плато. Описанный характер изменения удельной активности сохранялся при внесении в пробу разных количеств субстрата, что указывало на меньший вклад последнего в смещение равновесия между оли-гомерами НАД-киназы из сердца голубя по сравнению с изменением концентрации ферментного препарата в инкубационной пробе.

а, ед/нг

в, ед/нъ Щ

80 160 240 320L~,HKi/tv Б

10 Е/тг/мл

J

-о-

I I

I 1 I

№ too 300 400Е,тг/м

Рис. 2. Зависимость удельной активности от концентрации белка в инкубационной пробе.

По оси абсцисс — концентрация белка; по оси ординат — удельная активность

НАД-киназы.

А — НАД-киназа из скелетных мышц кролика; Б — НАД-киназа из сердца голубя: /—частично очищенный свежевыделенный препарат; 2 — тот же препарат, исследованный через месяц; 3— гомогенный препарат; В — НАД-киназа из печени кролика (а-форма, Мг 180 000): /—гомогенный фермент без добавок; 2 — добавлена фракция, содержащая активатор в 5-кратном количестве по отношению к концентрации фермента; 3 — добавлен БСА в 5-кратном количестве по отношению к концентрации фермента

Меньшую степень зависимости а от [Е]„ наблюдали для постаревшего (хранившегося в течение месяца пр*и —9° С) препарата (рис. 2 Б, кривая 2). Уменьшение зависимости а от [Е], можно •объяснить, по-видимому, частичной утратой способности к ассоциации при старении ферментного препарата. В то же время удельная активность эле'ктрофоретически гомогенных препаратов

143

"не зависела от концентрации фермента в инкубационной пробе, что можно рассматривать в качестве еще одного . доказательства полной утраты таким ферментом способности к ассоциации при повышении концентрации белка ферментного препарата в среде инкубации.

Как можно было ожидать, частично очищенные препараты НАД-кииазы из печени кролика тоже обнаруживали зависимость а от [Е]„ тогда как удельная активность гомогенных препаратов не зависела от концентрации фермента (рис. 2 В, кривая /). Отсутствие такой зависимости, по-видимому, обусловлено утратой гомогенными формами фермента способности к ассоциации или диссоциации, несмотря на то, что НАД-киназа из печени кролика, в отличие от фермента из сердца голубя, сохраняет четвертичную структуру после ионообменной хроматографии. Как было отмечено выше, при изучении зависимости а от [Е]0 для частично очищенных ферментов из скелетных мышц кролика и сердца голубя не представлялось возможным оценить вклад каждой из форм в удельную активность препарата вследствие легкого взаимного перехода в разной степени ассоциированных олигомеров. В случае НАД-киназы из печени кролика удалось определить удельную активность отдельных олигомеров, получаемых после фракционирования на ионообменнике, в силу того, что они утратили способность к ассоциации — диссоциации. Из данных таблицы 1 следует, что олигомеры а-типа НАД-киназы с молекулярным весом 280000—290000, 180000—190 000 и 150 000—160000 демонстрируют удельную активность 20—30, 10—20 и 3,6 ед./мг соответственно. Для олигомеров р-типа фермента с молекулярным весом 280000—290000 и 210 000—220000 удельная активность выражается величинами 130 и 160 ед./мг соответственно. Полученные результаты подтверждают высказанное на основании зависимости а от [Е]„ предположение о различной каталитической активности множественных молекулярных форм НАД-киназы.

Молекулярная гетерогенность НАД-киназы и различная каталитическая активность олигомеров находят свое выражение в сложном кинетическом поведении фермента. На кривой зависимости v от [S]„ для фермента из скелетных мышц кролика проявляются перегибы и промежуточный максимум (рис. 'ЗА, кривая /). Форма таких кривых варьирует при изменении рН инкубационной среды и зависит от длительности хранения ферментного препарата и концентрации фермента. НАД-киназа из скелетных мышц кролика имеет несколько оптимумов рН [23].

Следует заметить, что при значительном повышении концентрации белка в пробе (рис. ЗЛ, кривая 2) сложная кривая зависимости v от [S]0 значительно упрощается и представляет собой гиперболу. Выражение той же зависимости в обратных координатах дает возможность рассчитать значение /С[^АД1, равное 0,67-Ю-3 М.

Упрощение сложной кинетической кривой v от [НАД] до ги-

144

перболы наблюдали и при внесении в среду инкубации цАМФ-в конечной концентрации Ю-5 М [4]. Возможно, что цАМФ, как и повышение концентрации белка, способствует ассоциации олигомеров.

нмоль/ч-мг нмоль/ч-мг

Рис. 3. Зависимость скорости синтеза НАДФ от конц

страница 49
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.10.2019)