ентрации НАД. А— мплД-кииаза из скелетных мышц кролика: / — концентрация фермента в инкубационной пробе 56 мкг/мл; 2 — концентрация фермента в инкубационной пробе 224 мкг/мл; Б — НАД-киназа из сердца голубя: 1 — частично очищенный фер-, * мент; 2 — гомогенный фермент

Частично очищенные препараты НАД-киназы из сердца голубя по кинетическим параметрам во многом напоминают свойства фермента из скелетных мышц. Зависимость скорости синтеза НАДФ от концентрации НАД таких препаратов описывается, как. и в случае НАД-киназы из скелетных мышц, сложными по форме кривыми, имеющими промежуточный максимум и плато (рис. 3 ?, кривая 1). Поскольку исследуемые препараты фермента из сердца^ голубя всегда содержат несколько олигомерных форм, сложную1 кинетическую кривую можно рассматривать как сумму кинетических кривых, характеризующих отдельные олигомеры [7, 24]. Отмечено изменение формы кривой v от [НАД] при добавлении, в инкубационную среду разных количеств белка препарата НАД-киназы. Десятикратное увеличение содержания фермента в пробег (с 47 мкг до 470 мг) сопровождается некоторым упрощением кинетической кривой, однако она не превращается в гиперболу, как это имело место в случае НАД-киназы из скелетных мышц кролика.

С целью проверки специфичности эффекта повышения концентрации фермента на его удельную активность в реакционные-пробы, содержавшие препарат фермента, добавляли четырехкратный избыток сывороточного альбумина быка. Альбумин существенно не влиял ни на удельную активность фермента, ни на форду кинетической кривой.

Выше было показано, что НАД-киназа из сердца голубя прсле-

145.

счистки до гомогенного состояния утрачивает способность к оли-гомеризации. Изменение четвертичной структуры находит свое отражение и в кинетических свойствах фермента (рис. 3 Б, кривая 2). Удельная активность таких препаратов не зависит от концентрации фермента в среде инкубации, а зависимость v от [S]„ описывается гиперболой. IQVWl таких препаратов равна ¦0,1 мМ.

Наблюдаемые различия в кинетических свойствах частично ¦очищенных и электрофоретически гомогенных препаратов, по-видимому, сопряжены с утратой ферментом при очистке до гомогенного состояния присущих ему свойств диссоциирующей ферментной системы. . ,

Очистка сопровождается разрушением четвертичной структуры, гомогенный фермент из сердца голубя представлен мономером, не способным к ассоциации при повышении концентрации •белка в растворе. Однако нельзя было полностью исключить возможности перехода мономера НАД-киназы в присутствии субстратов реакции в более ассоциированное состояние. Для решения поставленного вопроса провели иммобилизацию фермента и показали, что иммобилизованный мономер способен осуществлять синтез НАДФ. Последнее обстоятельство явилось доказательством ;гого, что мономер обладает каталитической активностью и, по-видимому, не способен в присутствии субстратов к ассоциации.

Возвращаясь к частично очищенным препаратам НАД-киназы, рассмотрим вопрос о типе взаимных переходов олигомерных форм «фермента. Хорошо известно, что для быстро диссоциирующих •ферментных систем форма кривой зависимости v от [S]„ определяется концентрацией фермента только в реакционной среде, но не в исходном растворе. Для медленно диссоциирующей системы, кинетическое поведение которой зависит от состояния равновесия между олигомерами в исходном растворе фермента, решающее значение приобретает его «предыстория», т. е. условия хранения ферментного препарата и его концентрация до внесения в реакционную среду [21].

Результаты опытов по определению зависимости удельной активности фермента от его концентрации, при проведении которых фермент разводили непосредственно перед началом инкубации, а также влияние концентрации фермента на ход кинетических кривых v от [S]„ указывают на возможность достаточно быстрых по сравнению со скоростью НАД-киназой реакции процессов диссоциации.

При исследовании влияния разведения на удельную активность НАД-киназы. из скелетных мышц кролика было отмечено любопытное явление — колебание активности в разведенных растворах фермента [25]. Если ферментный препарат, хранившийся при —15° С, разморозить, развести буфером и выдержать при 0°С определенное время, до добавления в среду инкубации, то активность НАД-киназы изменяется во времени. Колебания наблюдали

146

на протяжении двух часов после разведения. В размороженном, но не разведенном растворе колебаний активности при выдерживании его при 0° С в течение четырех часов не наблюдали. В случае преинкубации в присутствии ЛАД и АТФ (без Mg2+) колебания ферментативной активности прекращались.

При хранении в течение месяца при —9° С частично очищенных препаратов из сердца голубя также наблюдали периодические спонтанные колебания ферментативной активности.

В процессе хранения препарата происходит попеременное повышение и понижение ферментативной активности. Амплитуда, колебаний зависит от концентрации белка в хранящейся пробе~ Для неразведенного фермента отмечено плавное изменение активности на протяжении всего срока хранения. Для разведенногс* в 100 раз препарата характерны резкие скачки ферментативной активности. Если хранить такие препараты в присутствии субстрата (1 мМ НАД), то разведенный препарат НАД-киназы ведег себя при хранении подобно неразведенному [24].

Спонтанные колебания активности, фермента во времени после разведения были описаны для препаратов белков актомиозино-вого комплекса, креатинкиназы и некоторых других ферментов. [26, 27]. По мнению авторов, в основе отмеченных колебаний лежат периодические синхронные конформационные изменения молекул белка.

Мы склонны объяснить-обнаруженные при хранении препаратов НАД-киназы из скелетных мышц кролика и сердца голубя: колебания ферментативной активности медленными процессами: ассоциации — диссоциации олигомерных форм фермента, обладающих различной каталитической активностью. В разбавленных. растворах амплитуда колебаний увеличивается. Добавленные субстраты прекращают колебание активности, очевидно, фиксируя: имеющееся в системе в момент их добавления равновесие между олигомерными формами фермента или стабилизируя одну из олигомерных форм.

Таким образом, изучение четвертичной структуры и некоторых, кинетических свойств НАД-киназы из скелетных мышц кролика, сердца голубя и печени кролика позволило обнаружить большое сходство между этими ферментами. АнаЛ*из изложенного выше-материала, на наш взгляд, убедительно свидетельствует в пользу принадлежности всех трех НАД-киназ к диссоциирующим ферментным системам, регуляция активности которых может осуществляться путем смещения равновесия между олигомерными формами, обладающими различной каталитической активностью. При: этом обнаружены некоторые различия между ферментом из скелетных мышц кролика и сердца голубя в регуляции ферментативной активности. Из данных кинетических исследований препарата НАД-киназы из скелетных мышц кролика следует, что смещение равновесия между олигомерными формами происходит при изменении концентрации субстратов, рН среды инкуб