ю. По-видимому, активная форма отличается большой лабильностью и при электрофорезе может переходить в неактивную.

Исследовали влияние каждого из субстратов и их компонен-тбв (НАД, Mg-АТФ, АТФ, MgCl2) на структуру фермента прш УЦ. Оказалось, что решающее влияние на четвертичную структуру фермента оказывает Mg-АТФ. Общая активность образца после УЦ в присутствии НАД или АТФ не изменялась по сравнению* с активностью, определенной после УЦ в отсутствие субстратов,, тогда как в присутствии только Mg-АТФ картина распределения активности и белка аналогична наблюдаемой при УЦ в полной системе (HAД+Mg-ATФ). В обоих последних случаях доля активной формы составляет 15% общего белка фермента.

Открытым остается вопрос о том, обладает ли основная побелку форма фермента с Мг 240000 некоторой активностью. Скорее всего эта форма совсем неактивна, а незначительная активность, обнаруживаемая во фракции градиента данной формой, обусловлена переходом некоторой части белка из неактивной; в активную форму с момента фракционирования градиента сахарозы ио окончании УЦ до определения активности во фракциях.

При анализе методом УЦ другой формы а-типа НАД-киназы с меньшей удельной активностью (Мг 150 000) было показано, что» она также ведет себя как система, состоящая из активной и неактивной форм. Активная форма, как и в случае олигомера с Мг 180 000, имеет тетрамерную структуру.

Частично очищенные препараты НАД-киназы, подвергнутые УЦ в присутствии субстратов, обнаруживают в качестве основной каталитически активной все ту же форму с Мг 130 000.

Полученные результаты убедительно свидетельствуют, что основной, если не единственной активно работающей формой фермента а-типа как в гомогенных, так и частично очищенных препаратах является тетрамерная форма (04), которая, по-видимому, находится в равновесии с неактивной формой.

ч При УЦ препарата НАД-киназы В-типа были получены аналогичные результаты. Электрофоретически гомогенный препарат {Мг 210 000) также разделяется при центрифугировании на активную (с Мг 120000—130 000) и неактивную (с Мг 240 000) формы. Но,по сравнению с ферментом а-типа большая часть фермента 6-типа присутствует в активной форме: в отсутствие субстратов на долю этой формы приходится 15% белка, а в их присутствии — 40%. При этом наблюдается повышение активности исследуемого образца фермента в 2,5 раза.

Так как молекулярный вес субъединицы В-типа НАД-киназы равен 62 000, активная форма является димером. Помимо актив-

156

ной димерной формы в препарате фермента р-типа обнаруживается еще одна — с Мг 190 000 (тример), доля которого при УЦ в присутствии субстратов уменьшается (см. рис. 5 Б, II).

Таким образом, на основании результатов, полученных при исследовании электрофоретически Гомогенных препаратов а- и р-ти-пов НАД-киназы с помощью метода УЦ в градиенте плотности сахарозы, можно сделать следующее заключение: (1) гомогенный,, по данным электрофореза, фермент при УЦ разделяется на две основные формы — каталитически активную и неактивную. (2) В присутствии субстратов (НАД и Mg-АТФ) наблюдается переход фермента из неактивной формы в каталитически активную. При этом в активную форму может перейти только часть неактивного фермента. В случае а-типа НАД-киназы доля эта незначительна и составляет 15%, для р-типа фермента показан переход в активную форму 40% неактивного белка. (3) Переход большего-количества белка в активную форму в присутствии субстратов-сопровождается повышением общей активности образца фермента. (4) Каталитически активными формами а- и р-типов НАД-киназы являются тетрамер и димер соответственно.

Можно думать, что разные значения удельной активности, полученные для отдельных гомогенных форм а- и р-типов (см. табл. 1), обусловлены различным содержанием в них каталитически активной формы.

Механизм перехода неактивного гекса- или тетрамера в активный тетрамер (а-форма) или димер (р-форма) неизвестен. Непонятной остается причина лишь частичного перехода неактивной" формы в активную. Нам не удалось повысить долю активной формы такими воздействиями, как продолжительная инкубация в присутствии субстратов, или увеличение в 5 раз концентраций: НАД и Mg-АТФ. •

Мы не нашли в доступной нам литературе аналогичных данных о разделении при УЦ в присутствии субстратов олигомерных. белков на каталитически активные и неактивные формы. Возможно, что отсутствие подобных результатов объясняется тем,, что при исследовании четвертичной структуры ферментов методом УЦ в условиях протекания ферментативной реакции месте-локализации фермента в центрифужной пробирке определяли исключительно по активности. По этой причине присутствие неактивной белковой фракции могло остаться просто незамеченным. "Между тем нельзя, по-видимому, полностью исключить возможности существования и для -других ферментов каталитически активной и неактивной форм. Высказанное соображение можно проиллюстрировать следующим примером. Из данных литературы известно, что молекулярный вес гомогенного препарата НАД-киназы из печени голубя, определенный методом гель-фильтрации, равен 270 000 [19]. Мы анализировали методом УЦ в присутствии субстратов частично очищенные препараты фермента из печени, голубя и не смогли обнаружить каталитически активной формы с таким высоким молекулярным весом. Однако 60% активности

157-

^приходилось на форму с Мг 133 000. Эти результаты указывают иа то, что в данных условиях каталитически активной формой «фермента из печени голубя является, по-видимому, тетрамер (на-.помним, что Мг субъединицы фермента равен 34000).

Как и следовало ожидать, для диссоциирующих ферментов молекулярный вес активно работающей формы зависел от количества взятого на анализ белка. Так, при низких концентрациях' фермента (<12 мкг/мл) фосфофруктокиназа (ФФК) из мышц кролика представлена в основном мономером; при высоких кон-. центрациях фермента активно работающей формой фермента становится тетрамер [33]. При всех условиях (в отсутствие субстратов, при относительно низких концентрациях фермента и др.) работающая форма ФФК исходно присутствует в растворе и находится в равновесии с другими формами фермента. В присутствии субстрата ее доля увеличивается, и она становится преобладающей в системе [34, 40]. В этом отношении ФФК напоминает НАД-киназу из печени кролика, препараты которой при анализе в отсутствие субстратов обнаруживают незначительное количество активной формы. Доля последней увеличивается при УЦ в пол-¦ной системе. Однако сходство это относительное и полной аналогии между поведением обоих ферментов провести нельзя уже потому, что олигомерное состояние активной формы ФФК может меняться при изменении концентрации исследуемого образца, тогда как гомогенные препараты НАД-киназы, как уже неоднократно подчеркивалось, утратили способность к такого рода переходам. Кроме того, мы ничего не знаем о существовании каталитически неактивных форм ФФК.

Заключение

Вся совокупность изложенных данных указывает на существование достаточно сложной, многоступенчатой системы регуляции активности НАД-киназы