роблемная научно-исследователькая лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского МГУ)

Ровно 100 лет тому назад глубоководная драга экспедиционного корабля «Талисман» принесла живые организмы со дна моря, с глубины 6000 м. На такой глубине гидростатическое давление превышает 600 атм, и это сразу привлекло внимание к вопросу о влиянии давления на биологическую активность. Исследования, начатые на клеточном уровне (они продолжаются и по сей день), вскоре были дополнены изучением активности изолированных ферментов.

Однако увлечение техникой эксперимента привело к тому, что на протяжении нескольких десятилетий опыты проводили в области гидростатических давлений, по большей части намного превышавших 1200 атм — предельное давление в Мировом океане [1, 2]. В результате длительное время преобладало ошибочное •убеждение, что наиболее общим эффектом гидростатического давления является денатурация белков. Лишь после появления теории абсолютных скоростей реакций и разработки термодинамического аспекта ферментативных реакций под давлением [3, 4] появилось понимание важной роли объемных эффектов, сопровождающих эти реакции, и оживился интерес к умеренным гидростатическим давлениям, которые могут играть важную роль в жизнедеятельности глубоководных организмов.

В 60-е годы было обнаружено, что межсубъединичные белок-белковые взаимодействия также могут сопровождаться значительными изменениями парциальных объемов. В зависимости от знака этих изменений гидростатическое давление приводит к многократному увеличению или уменьшению константы ассоциации бел-.ков, состоящих из нескольких субъединиц. Интересные проявления этих эффектов обнаруживаются в скоростных опытах на ультрацентрифугах [6—8].

Способность умеренно высокого гидростатического давления вызывать диссоциацию олигомерных белков в отсутствие таких денатурирующих агентов, как мочевина, гуанидин-хлорид, детергенты, придает этим исследованиям двоякий интерес: во-первых, количественное определение изменения парциального мольного объема позволяет делать некоторые заключения о природе меж-субъединичных контактных участков, во-вторых, высокая степень обратимости диссоциации под давлением дает возможность при-

6 Заказ 423

161

близиться к моделированию естественных условий формирования четвертичной структуры [9].

Экспериментальные способы наблюдения эффектов давления весьма разнообразны и охватывают практически все методы, применяющиеся для изучения белков и ферментов.

В данной работе кратко излагаются теоретические основы воздействия умеренного гидростатического давления на ферменты, описывается разработанная в Межфакультетской лаборатории им. А. Н. Белозерского МГУ оригинальная оптическая кювета для спектрофотометрического изучения ферментативной кинетики под давлением и приводятся некоторые результаты исследования лак-татдегидрогеназы.

Основные понятия

Гидростатическое давление оказывает воздействие на химические реакции, в том числе на ферментативные, прежде всего через объемные эффекты этих реакций [10]. Только такой тип воздействия мы будем здесь рассматривать, . оставив в стороне другие возможные эффекты, как, например, сдвиг рК буферных солей, увеличение парциального давления растворенных газов и т. д. Точно так же не будут затронуты вопросы, возникающие при воздействии на систему сжатыми газами.

В теории абсолютных скоростей реакции постулируется, что все химические реакции проходят через промежуточное активированное состояние Х^, которое находится в равновесии с реагентами:

A+B^X*=->C + D. (1)

Важнейший вывод теории заключается в том, что скорость образования продуктов С и D пропорциональна концентрации промежуточных активированных комплексов [Х^], и следовательно, константа скорости реакции k пропорциональна константе квазиравновесия 1

К*- . [А] [В]

В равновесной термодинамике константа равновесия связана с приращением стандартной свободной энергии Гиббса: AG° = =—RT In К, а следовательно, AG°*= — RT In К*= — RT In k+ + const. Отсюда вытекает, что константы Кф и k являются функциями давления Р [12]:

/ d In К* , _ / д In k \ __1 / <3AG°* \ AV*

[ дР )т~\ <ЭР )т~ RT \ дР /т RT

где «активационный объем» AV^ есть

1 Глубокое обсуждение физического смысла К°* и последующих термодинамических соотношений читатель найдет в [22].

162

AV'b = Vx^-(VA+ VB). (3)

т. е. равен приращению парциального мольного объема реагентов при образовании активированного комплекса.

Формула (2) показывает, что AV^ можно определить из наклона графика зависимости In k от Р. Если же АУФ от давления не зависит, то уравнение (2) интегрируется. В этом случае

K* = Kt* = V~PA^/RT- (5) "(где индекс «о» обозначает атмосферное давление) и

— . • In km — In

ДУ* = — RT-^-(6

Р2 - Pi

Важно отметить, что непосредственно измерить парциальный объем активированного комплекса практически невозможно, и поэтому ?\\ф оказывается единственной доступной измерению объемной характеристикой, указывающей на те изменения, которые сопровождают образование (и распад) этих промежуточных состояний.

Написанные соотношения применим к простейшей ферментативной реакции

E + si ES-^E + P. (7)

сделав добавочные упрощающие предположения. 1. Рассмотрим случай, когда k%При этом уравнение для скорости реакции v = dP/dt можно переписать в виде [3]

v= *'4E1[S1 , (8)

где константа равновесия

К = [ES] = -А- (9) [Е] [S] А_х '

я следовательно,

К = K0e_p^/RT. (Ю)

Здесь AV — парциальный мольный объем реакции E + S+*ES, т. е.

AV=VES — (Ve+Vs), (11)

и предполагается, что AV от давления не зависит. k2 в уравнении (8) зависит от давления согласно формулам (2) или (5). Но что-

6' 163

бы вскрыть смысл, который в рамках .уравнения (7) (и при условии k2<^k-i) имеет измеряемый на опыте объем активации, запишем вторую стадию реакции (7) в соответствии с теорией абсолютных скоростей реакций:

ES^Xf->E + P, (12)

где

Kf = -gI=K?oe-pA^/RT, ' (13)

[ESJ

и как в (5)

k% = k2.0 е-р^Т'*\ (14)

где аналогично (3)

AV? =VX* — Yes , (15>

т. е. AV|* есть приращение парциального мольного объема комплекса ES при переходе в промежуточное активированное состояние х?.

Подставив теперь (10) и (14) в (8), получаем

v =-—---. (Ibf

l+K„[S]^-pAV/RT

В двух крайних экспериментальных ситуациях это уравнение упрощается и позволяет извлечь из опыта полезную информацию:

а) если K[S]^>1, то из (8) и (14) находим

v = ki[E] = k2,0[E]e-pA'**/RT; (17)

б) если, наоборот, K[S] v = k2.0 К„ [Е] [S] е-ил уГ+лу,/кт (18>

Следовательно, измерения, произведенные при большой концентрации субстрата (точнее, при [S]^-l/K), позволяют с помощью (17) определить д"у|*— активационный объем реакции диссоциации продуктивного комплекса ES. При низкой концентрации субстрата аналогичные измерения под давлением дают возможность с помощью (18) вычислить суммарный объемный эффект A V* = AV2' + AV. Для дальнейшего это выражение удобно с