го способа наблюдения и от диапазона давлений. Выше 2—3 тыс. атм изучаются преимущественно денатурационные изменения, а при давлениях до 1—2 тыс. атм — главным образом объемные эффекты, сопровождающие ферментативные реакции.

В исследованиях ферментативной кинетики наибольшие затруднения вызывает проблема сокращения интервала времени между началом реакции и началом ее регистрации. Чаще всего (см. напрамер, [23—26]) реакция запускается при атмосферном давлении, после чего кювету герметизируют, устанавливают в регистрирующий прибор и поднимают давление. И лишь через 1—3 мин, в течение которых устанавливается на заданном уровне температура раствора, возрастающая при адиабатическом повышении давления примерно на 2° С/1000 атм [24], начинают регистрировать ход реакции. Таким образом, начальный участок реакции на протяжении 2—8 мин остается вне наблюдения. Более того, в большей части работ (например, [19, 23—26]) активность измерялась лишь после извлечения раствора из кюветы, в которой он определенное время выдерживался под далением.

Для запуска реакции под давлением предложены кюветы с бойком, который в нужное время разбивает перегородку, отделяющую друг от друга находящиеся под давлением реагенты, и перемешивает их [27—28]. Первая из этих кювет ([27]) рассчитана на последующую регистрацию кинетики в спектрофотометре, но мертвое время между запуском реакции и началом измерений едва ли можно сделать меньше 10 с. Вторая кювета ([28]) не предназначена для непосредственных оптических измерений. Она снабжена шприцевым устройством для отбора проб без декомпрес~ сии раствора и определения активности через заданные промежутки времени.

Много информации получено с помощью разнообразных устройств для исследований релаксационной кинетики после скачкообразного изменения какого-либо параметра, в частности давления [29]. Очень интересный прибор для исследования быстрой кинетики под давлением (до 1200 атм) с помощью метода остановленной струи описан недавно Эремансом [30].

В тех случаях, когда ферментативная реакция сопровождается изменением оптической плотности реакционной среды, естественно использовать абсорбционную спектрофотометрию.

168

В Межфакультетской проблемной лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского Московского университета разработана спектрофотометрическая кювета, позволяющая начинать реакцию через произвольное время после повышения давления, причем до начала реакции фермент может находиться либо под высоким давлением, либо при 1 атм. В любом случае регистрация кинетики начинается примерно через секунду (или раньше) после начала реакции [31].

На рис. t А и 1 Б показаны схемы ячейки для проведения реакции и кюветы высокого давления. Ячейка (1) имеет цилиндрическую форму, изготовлена из полированного снаружи и изнутри

1см

Рис. 1. Кювета высокого давления. А — ячейка для запуска и проведения ферментативной реакции под гидростатическим давлением: /—цилиндрическая ячейка; 2 — стальная шайба, закрепленная в дне ячейки; 3 — пластмассовая чашка; 4 — постоянный магнит, приклеенный к чашке; 5 — коническая крышка с отверстием для заполнения ячейки и передачи давления.

Б — оптическая кювета высокого давления (изготавливается из немагнитной нержавеющей стали): 1 — цилиндрическая полость для установки реакционной ячейки; 2 — запорная крышка; 3 — канал для подключения к гидравлическому насосу высокого давления; 4 — магнитопровод; 5 — съемный соленоид для запуска реакции; 6 — штуцер для подключения к ультратермостату; 7 — кварцевые цилиндрические окна; 8 — гайкн для крепления окон; 9 — тефлоновые уплотняющие кольца — прокладки

169

плексигласа и ее объем составляет около 2,5 мл. Снаружи в дне ячейки имеется круглое углубление, в котором закрепляется и изолируется от внешней среды стальной диск (2). Сверху ячейка закрывается крышкой (5) с конической внутренней поверхностью и отверстием. Для проведения опыта в углубление миниатюрной пластмассовой чашечки (3) микрошприцом вводят строго дозированное количество (например, 10 мкл) одного из главных реагентов — фермента или субстрата. Чашечка имеет полированный бортик, которым она прижимается ко дну ячейки, как показано на рис. 1. К наружной поверхности дна чашечки приклеен плоский цилиндрический постоянный магнит (4) (диаметром примерно 5 мм, толщиной 3 мм), который, притягиваясь к диску (2), удерживает чашечку в прижатом ко дну ячейки положении вплоть до сигнала о начале реакции. Для улучшения контакта чашечки с дном ячейки контактные поверхности предварительно смазывают очень тонким слоем инертной смазки (например, вазелиновым маслом).

После установления заполненной чашечки на место ячейку споласкивают водой (избыток которой отсасывают шприцем с пластиковым наконечником) и заполняют реакционной средой со вторым необходимым реагентом. Среду наливают с небольшим избытком, так, чтобы образовался выпуклый мениск, и закрывают ячейку крышкой (5). Коническая форма крышки и отверстие помогают полностью удалить из ячейки пузыри воздуха. В заключение сборки ячейки отверстие заклеивают с помощью вазелиновой смазки небольшим лоскутом гибкого тонкого полиэтилена.

Собранную ячейку вставляют в предварительно заполненную водой цилиндрическую полость (1) в кювете, которая показана на рис. 1 Б, плотно завинчивают верхнюю крышку (2), с помощью гибкой стальной трубки подключают кювету через канал (3) к поршневому гидравлическому насосу и устанавливают в спектрофотометр. На выступающий магнитопровод (4) надвигают соленоид (5), на штуцера (6) надевают резиновые шланги от ультратермостата. Кварцевые окна (7) в стальных оправах (8) с помощью тефлоновых колец (9) герметизируют кювету. Крышку кюветного отделения спектрофотометра закрывают и поднимают давление. Реакция при этом не запускается, и поэтому можно выждать столько времени, сколько необходимо для выравнивания температуры на заданном уровне. Содержимое ячейки находится все это время под заданным гидростатическим давлением, которое передается от заполняющей кювету воды через гибкий полиэтилен, закрывающий отверстие в ячейке. Если после этого заполнения ячейки в ней не осталось пузырей воздуха, то полиэтилен не продавливается и не пропускает воду в ячейку.

Для запуска реакции соленоид с помощью кнопочного выключателя кратковременно (—0,5 с) подключается к источнику переменного тока (регулируемого автотрансформатора), напряжение которого должно быть подобрано так, чтобы (при данном соленоиде) переменное магнитное поле отрывало от дна ячейки

170

чашечку с приклеенным магнитиком и заставляло ее совершить достаточное для полного перемешивания среды число оборотов.

Регистрацию оптической плотности на избранной длине волны начинают за некоторое время (10—20 с) до включения соленоида, и это дает возможность точно зафиксировать на диаграммной бумаге момент начала реакции (а также проконтролировать отсутствие реакции до этого момента из-за подтекания реагента из чашечки) (рис. 2).

/' 3' 10'

Рис. 2. Кинетика лактатдегидрогеназной реакции под давл