онтроля за физиологической гибелью клеток и, как следствие, увеличивается число некротизированных клеток (Хавинсон, Кветной, 2000). В настоящее время оценка количества клеток, входящих в апоптоз, является значимой в медицинской практике при клинико-иммунологическом обследовании (Ярилин и др., 2000).

3.3. Модельные и природные нуклеопротеиновые комплексы

Помимо того что молекула ДНК представляет собой способ хранения генетической информации, она, как было показано в разделах 3.1 и 3.2, является макромолекулой с особыми физико-химическими характеристиками и обладает уникальными регуляторными свойствами. В частности, известно, что в клетках и тканях ДНК способна проходить через клеточную и ядерную мембраны (Simon, 1992). После этого макромолекула может быть расщеплена специфическими нуклеазами, а ее фрагменты способны принять участие в регуляции некоторых процессов клеточного цикла. Например, биологическая активность фрагментов ДНК была использована при создании иммуномодулятора Деринат, который представляет собой 1.5%-ный раствор высокоочи-щенной натриевой соли нативной ДНК (дезоксирибонуклеат натрия) из молок осетровых рыб, деполимеризованной ультразвуком и растворенной в 0.1%-ном водном растворе хлорида натрия (Урсова, 2000).

Повышение способности биоактивных макромолекул проникать сквозь клеточные мембраны составляет одну из важных задач современной биотехнологии и медицины. Трудности, связанные с преодолением мембранного барьера клеток, ограничивают возможности направленного транспорта лекарств, генетической трансформации клеток, регуляции внутриклеточных процессов экзогенными белковыми факторами (Марьянович, Поляков, 1991). Одним из подходов к преодолению подобных трудностей является комплек-сообразование биологически активных веществ с полимера-

152

ми, которое препятствует деградации белковых факторов гидролитическими ферментами либо придает им недостающие свойства для проникновения в клетку. Нуклеиновые кислоты удовлетворяют всем требованиям, необходимым для полимеров-носителей, и в первую очередь обладают биосовместимостью (Панарин, 1989). При образовании Интерпол и электролитных комплексов (ИПЭК) нуклеиновых кислот с линейными синтетическими поликатионами происходит кооперативное связывание электростатически комплементарных цепей, сопровождающееся экранированием заряда фосфатных групп нуклеиновой кислоты, которое приводит к формированию гидрофобного участка в макромолекуле. Число и протяженность таких участков задаются степенью полимеризации блокирующего поликатиона и составом поликомплекса. Для проявления биологической активности нуклеиновой кислоты необходимо ее специфическое узнавание белками-регуляторами и ферментами. Далеко не всегда образование ИПЭК приводит к потере возможности такого распознавания. Например, проведенные исследования показали, что поли-Г\1-этил-4-винил-пиридиний бромид, связанный с ДНК, не препятствует ее специфическому узнаванию. Поликатион перемещается по цепи ДНК с одних участков на другие, открывая места для рестрикции. Эксперименты по оценке эффективности трансформации указывают на перспективность применения таких комплексов для генной инженерии (Кабанов и др., 1989).

В то же время чужеродная ДНК может встраиваться в геном других клеток и изменять набор продуктов эндогенного белкового синтеза. В ряде работ (Кабанов, Кабанов, 1994; Дебабов, 1997) определены перспективы использования этого свойства для ДНК-вакцинации и генотерапии, а также для доставки генетического материала в клетку. Однако до настоящего времени в полной мере не исследованы свойства ДНК как поверхностно-активного вещества. Эти исследования могли бы прояснить механизмы проникновения макромолекул таких размеров через цитоплазматиче-скую мембрану и обосновать с точки зрения коллоидной химии возможность введения экзогенной информации в геном клетки.

Для направленной доставки чужеродного генетического материала в клетку без повреждения ее мембраны было предложено использовать ИПЭК инсулин-поли-Ь-лизин-ДНК (Розенкранц и др., 1990). Инсулин является лигандом, который специфически узнает рецептор на поверхности клет-

153

ки, а поли-Ь-лизин обеспечивает его нековалентную связь с ДНК. Такой конъюгат обеспечивает селективную и целенаправленную доставку чужеродного генетического материала в клетки млекопитающих и растений посредством рецептор-опосредованной интериализации (эндоцитоза). Была также доказана эффективность этого метода трансфек-ции и показана целесообразность его применения in vivo.

Изучение селективности связывания ДНК с модельными неспецифическими белками, которые различаются кислотно-основными свойствами и не являются типичными компонентами клеточного ядра, представляет интерес для понимания свойств ДНК как полимера-носителя, на базе которого формируются нуклеопротеиновые комплексы с различными физиологическими свойствами. Нами было проведено изучение количественных закономерностей и механизмов образования подобных комплексов в модельных системах (Ряднова и др., 2000а); были исследованы закономерности связывания ДНК из селезенки, крупного рогатого скота с глобулярными белками, которые различаются кислотно-основными свойствами: пепсином (рК = 2.0), инсулином (рК = 5.4), кортексином (рК = 9.5), цитохромом С (рК = = 10.6) и протамином (рК = 11.5). В физиологических условиях суммарный заряд этих белков варьировал от 36~ для пепсина до (30—32)+ для протамина. Несмотря на то что ДНК несет отрицательный суммарный заряд на своей поверхности, в интервале ионной силы от 0.1 до 0.5 н наблюдается образование устойчивых нуклеопротеиновых комплексов ДНК со всеми исследованными белками. Причем при комплексообразовании не происходит «расплетания» двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, о чем бы свидетельствовал гиперхромный эффект — резкое увеличение поглощения в УФ-области при длине волны 260 нм. На рис. 13 представлена хроматография и рехроматография комплекса ДНК—инсулин на сефадексе G-150 при ионных силах раствора 0.3 и 0.5 н. На хроматограмме регистрируются два пика. Первый пик выходит с объемом задержки колонки, второй пик — с объемом, значительно превышающим объем задержки свободного белка, не связанного в комплекс. На рехроматограмме (рис. 13, Б) высокомолекулярной фракции обнаруживается только пик нуклеопротеинового комплекса, что свидетельствует о его устойчивости даже при повышенной ионной силе раствора (Шатаева и др., 1999).

Во всех исследованных системах процесс комплексооб-разования проходил по кооперативному механизму, но в

154

Е С

Рис. 13. Гель-хроматография комплекса ДНК—инсулин (Sephadex G-150).

А — гель-хроматография исходного раствора, ионная сила 0.3 н; Б — рехроматография первого пика хроматограммы комплекса ДНК—инсулин, ионная сила 0.5 н. Е — оптическая плотность при длине волны 260 нм; V — относительный объем выхода; С — концентрация белка (мг/мл).

каждом случае стехиометрия и прочность связывания ДНК с белками зависели от концентрационного соотношения компонентов в комплексе и от природы белка (Ряднова и др., 2000а)