.

Как уже отмечалось, нуклеиновые кислоты очень перспективны для использования в качестве полимерных носителей биологически активных веществ с целью защиты последних от ферментативного гидролиза и облегчения их достави к органу- или клетке-мишени. Нами была исследована устойчивость комплексов ДНК с инсулином, пепсином и кортексином к гидролизу ДНКазой и трипсином. Оказалось, что эти ферменты не разрушают комплексы и не гидролизуют белок, связанный в комплекс. Это, безусловно, свидетельствует о перспективности применения комплексов ДНК с белками и пептидами для создания пероральных лекарственных форм препаратов, обладающих регуляторными функциями.

Известно, что конформация ДНК является важным фактором как для реализации генетической программы клетки, так и для проникновения экзогенной ДНК в ядро. В ряде работ было показано, что при взаимодействии ДНК с щелочными белками класса гистонов происходит компактиза-ция макромолекулы, степень которой зависит от весового соотношения ДНК/гистон (Мартынкина и др., 1991, 1998). Нами также было показано, что процесс комплексообразо-вания ДНК зависит от исходного количественного соотношения компонентов в растворе и определяет степень (плот-

155

ность) заполнения молекулы ДНК белком. В свою очередь степень заполнения определяет морфологию образующихся нуклеопротеиновых комплексов (НПК). На рис. 14 представлены изменения характеристической вязкости растворов ДНК от плотности заполнения жесткоцепной макромолекулы ДНК глобулярными молекулами белка. Очевидно, что при увеличении плотности заполнения ДНК белком характеристическая вязкость растворов НПК уменьшается. Предельные значения характеристической вязкости НПК при максимальном заполнении ДНК глобулярными белками очень близки для всех исследованных систем. Однако процессы компактизации ДНК при ее постепенном заполнении белками, различающимися кислотно-основными свойствами, идут по-разному. В частности, при взаимодействии ДНК с инеулином происходит постепенное уплотнение структуры комплекса, затем образование конфигурации «ожерелье», аналогичной обнаруженной при взаимодействии ДНК с гистонами (Киселева и др., 1998). По-видимому, именно компактизация структуры комплекса ДНК—инсулин обеспечивает его устойчивость при увеличении ионной силы раствора и действии гидролитических ферментов. В связи с тем что получение новых лекарственных форм инсулина является насущной проблемой эндокринологии (Власов и др., 1988; Валуев и др., 1998), представляется целесообразным продолжение исследований комплексов ДНК—инсулин и изучение биологической активности инсулина, включенного в НПК.

При связывании ДНК с цитохромом С процесс компактизации протекает намного интенсивнее. Уже при низких концентрациях белка образуются нелинейные структуры типа «ожерелье», так как щелочная природа боковых групп цитохрома С облегчает его локальные многоточечные взаимодействия с фосфатными группами ДНК. Поэтому при взаимодействии ДНК с цитохромом С не возникает надмолекулярных структур НПК.

В случае образования комплекса ДНК с пепсином (самым кислым из всех исследованных белков) снижение характеристической вязкости НПК наблюдается уже при невысоком содержании белка в системе. Очевидно, что вопрос о механизме образования комплексов ДНК с кислыми белками требует дальнейших исследований и расширения методических подходов, так как именно кислые регуляторные белковые факторы хроматина участвуют в расплетании двойной спирали ДНК (Ряднова и др., 2000а).

156

•О- 2 -+- 3 ¦о 4

¦о

О 10 20 30 40 п

Рис. 14. Зависимость характеристической вязкости ДНК [т\] {мл/т) и ее комплексов от количества связанного белка.

[п]о — свободная ДНК; нуклеопротеиновые комплексы; / — ДНК—цитохром С, 2 — ДНК—инсулин, 3 — ДНК—пепсин, 4 — ДНК—кортексин. и — среднее количество молекул белка, связанных с молекулой ДНК.

Исследование концентрационных закономерностей формирования модельных комплексов ДНК с белками и оценка их устойчивости в физиологических условиях позволяют экстраполировать эти закономерности на природные НПК, выделенные из разных тканей. Применение модельных или природных НПК в медицинских целях для коррекции функций поврежденных или стареющих тканей облегчается из-за высокой устойчивости этих препаратов к действию гидролитических ферментов желудочно-кишечного тракта.

Перспективность проведенных в этом направлении исследований подтверждается эффективностью природных НПК, выделенных из различных органов и тканей, — ци-таминов, применяемых в медицинской практике для коррекции физиологических нарушений отдельных функций организма, в частности при ослаблении иммунитета и памяти в результате стресса и физических нагрузок (Морозов и др., 2000а; Хавинсон и др., 2001г).

Технологический прием, положенный в основу получения природных нуклеопротеиновых комплексов, состоит в том, чтобы в условиях мягкого щелочного гидролиза клетки сохранить структурные элементы хроматина, в которых эндогенные регуляторные пептиды естественно объединены и связаны с соответствующими специфическими участками ДНК. Одновременно на стадии экстракции протекает частичный гидролиз линкерных участков ДНК сопутствующими эндогенными ДНКазами. Продукты такого гидролиза (олигомеры) отделяются на стадии осаждения НПК.

Присутствие гликолипидных и фосфолипидынх компонентов мембран в препаратах, полученных на первом этапе выделения, затрудняет растворимость комплексов. Делипи-

157

дизация препаратов с помощью хлороформа, который является универсальным растворителем для всех классов липидов (лецитинов, цефалинов и сфингомиелинов), увеличивает растворимость НПК и улучшает качество хроматографического анализа состава этих комплексов (Препаративная биохимия липидов, 1981).

В зависимости от типа ткани, из которой выделены НПК, составы препаратов различаются соотношением белков и липидов. Содержание нуклеиновых кислот практически одинаково во всех препаратах, поскольку клетки всех дифференцированных тканей организма содержат одинаковый набор хромосомных нуклеиновых кислот.

Для оценки устойчивости полученных природных препаратов НПК по отношению к ферментативному гидролизу в желудочно-кишечном тракте использовали энзиматическую обработку этих комплексов. Как и в случае модельных НПК, после ферментативной обработки природных НПК в их высокомолекулярной фракции сохраняются полипептиды, прочно связанные с ДНК. Это является косвенным подтверждением того факта, что подобранные условия разрушения клетки и клеточного ядра на стадии получения препаратов НПК позволяют сохранить устойчивые элементы структур хроматина. Методами хроматографического анализа в препаратах НПК головного мозга обнаружены белки с молекулярными массами в области 20—24 кДа, которые, по-видимому, могут быть идентифицированы как кислые белки группы BASP, локализованные в синаптической области нейронов (Mosevitsky et al., 1994). Кроме того, во всех природных препаратах НПК содержатся низкомолекулярные пептиды — аналоги цитомединов (Кузник и др., 1995).

Проведенные физико-химическ