ции избытка присоединяемой

124

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

аминокислоты выход иа каждой стадии приближается к 100%- Для многократного автоматического повторения всего процесса были сконструированы специальные приборы. В твердофазном синтезе часто используются грег-бутокси-карбонильные производные аминокислот в сочетании с применением на стадии образования пептидной связи дициклогексилкарбодиимида (ДЦКД). Этот процесс может быть проиллюстрирован приведенным ниже циклом реакций с целью синтеза гипотетического полипептида. СООН-Концевую ?-защищенную аминокислоту с боковой R'-группой по реакции 1 присоединяют к нерастворимому полимеру П. При этом образуется комплекс аминокислота — полимер. После удаления защитных групп (реакция 2) по реакции 3 присоединяется следующая аминокислота с образованием блокироваииого дипептида. Повторяя реакции 2 и 3, получают полипептид желаемой длины и последовательности, который, может быть отделен от нерастворимого полимера по реакции 5.

СН,

О R10

сн3—(j:-o-c-NCHc:-o- + ?—сн2

сн.

R О

m ? ? и

i -Вое—?—СН—С—О—СН,

лтрстя-бдтогхикарбонил (i"-Boc)- нерастворимый

м и кислот

комплекс

трет-бутоксикарйониламинокислота -Полимер

©

CH^

со2 + СН3—С-СН3 изобугпилен

R О R HI" !| Н| f-Boc—NCHC—NCH-O-CH.

-..комплекс 1-Вос-сипелтисил-полимер

1. 1 и. НС1 в уксусной .слоте

1. (??,?,?* в

диметилформэмиде-

©

R О

I II

H„NCHC—О—СН,-

©

КОМПЛЕКС

аминокислота-полимер

•I циклов ? о ррюш,и>. сн реакций @и ©

t -Вое— полипелтид—О—СН,-

R Q

?-Boc—NHCH—С—ОН +

дцкд

©

1 реакция © , ,~.. г-—-^^-мюлипептид + НО—СН -л\ /Г

2 re рифт ?- - \ //

тпрст Ёутоксикарбонилзащ щен а олипептив полимер

С помощью существующих методов пептидного синтеза были получены многие природные полипептиды, некоторые белковые гормоны, в том числе инсулин? (гл. 46), гастрии (гл. 34) и паратгормон (гл. 43), а также фермент рибонуклеа-за. Таким образом, с помощью пептидного синтеза была доказана правильность структур, установленных с помощью методов деградации. Пептидный синтез используют также для получения аналогов природных соединений с целью исследования роли каждой боковой цепи или остатка в проявлении биологической, активности, а также для получения соединений с наиболее подходящими для терапевтических целей свойствами.

См. литературу к гл. 6.

Глава 5

БЕЛКИ. II

Определение молекулярной массы. Форма белковых молекул. Амфотерные свойства. Растворимость. Методы выделения биологических макромолекул

5.1. Определение молекулярной массы

Молекулярные массы некоторых типичных белков, приведенные в табл. 5.1, указывают на большое разнообразие их размеров. Для детального изучения взаимосвязи структуры и функции любого' белка необходимо знание его молекулярной массы. В следующих

Таблица 5.1

Молекулярные массы и изоэлектрические точки некоторых белков Белок Молекулярная ыасса Р/а

Цитохром с 13 000 10,6

Рибоиуклеаза 14 000 7,8

Миоглобин лошади 17 000 7,0

Гормон роста человека (соматотропии) 21 500 6,9

Карбоксипептидаза 34 000 6,0·

Пепсин 35 500 <1,6»

Яичный альбумин 40 000 4,6.

Гемоглобин лошади 65 000 6,9

Сывороточный альбумин 66 500 4,8

Сывороточный ?-глобулин 160 000 6,4—7,2?

Каталаза 250 000 5,6

Фибриноген 330000 5,5

Уреаза 480 000 5,1

Тиреоглобулии 660 000 4,6.

Гемоцианин осьминога 2 800000

рН в изоэлектрической точке (см. разд. 5.3).

Я 26

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

ось вращения

И

и

6

седимента-

а

!Рис. 5.1. Схема устройства ротора уль7рацентрифуги. а — вид сбоку; 6 — вид ¦сверху. / — ячейка; 2 — кварцевое стекло; 3—источник света; 4 — оптическая анализирующая система; 5 — противовес.

разделах описываются некоторые методы определения молекулярных масс белков, причем особое внимание обращается на ряд наиболее важных свойств белковых молекул в растворе.

5.1.1. Метод измерения скорости седиментации

Скорость осаждения частицы в центрифужной пробирке под действием центробежной силы зависит, во-первых, от величины этой силы, во-вторых, от размера, формы и плотности частицы и, в-третьих, от плотности и вязкости растворителя. Центробежные силы, достигаемые в настоящее время, позволяют производить разделение только относительно крупных молекул. Современные центрифуги, основанные на использовании высокоскоростных электрических двигателей, способны развивать скорость до 75 ООО об/мин, и получаемая при этом центробежная сила в 400 000 раз превосходит силу земного притяжения. Вращение роторов в таких центрифугах происходит в вакууме для того, чтобы свести к минимуму сопротивление воздуха и уменьшить нагревание при трении.

Для понимания поведения белков в центробежном поле полезно рассмотреть устройство ротора ультрацентрифуги (рис. 5.1), а также обсудить изменение концентрации белка в ячейке ультрацентрифуги в процессе седиментации (рис. 5.2). В результате постепенного изменения концентрации белка через некоторое время образуется четкая граница между растворителем и раствором белка. Измерение положения этой границы в зависимости от времени позволяет определить константу седиментации, являющуюся функцией молекулярной массы. За скоростью седиментации можно следить с помощью нескольких методов. Один из них заключается в следующем: через кювету пропускают ультрафиолетовый свет (230— 290 нм) и регистрируют его поглощение (величина которого про-

5. БЕЛКИ. II

127

Рис. 5.2. Изменение концентрации с белка (а) и градиента концентрации dc/dxr (б) в ячейке ультрацентрифуги на различных стадиях центрифугирования. Направление седиментации — слева направо. А — верх ячейки; В — дно ячейки; ?—расстояние от оси вращения; / — время. Перед началом центрифугирования концентрация белка во всех точках ячейки одинакова, и dc/dx=0. Через время /] происходит частичная седиментация белка, и его концентрация увеличивается в направлении ко дну ячейки; в верхней части ячейки концентрация белка близка-к нулю. Изменение с и dc/dx во времени при дальнейшем центрифугировании иллюстрируется соответствующими кривыми (t^, /3 и /4).

порциональна концентрации белка) от верхней границы раствора до дна кюветы. За положением границы между раствором белка и растворителем можно наблюдать также с помощью шлирен-опти-ки. При этом через кювету также пропускают свет и регистрируют изменение показателя преломления по высоте кюветы, которое пропорционально изменению концентрации белка. Изменение показателя преломления на границе растворителя и раствора белка регистрируется как градиент концентрации dc/dx (рис. 5.2). Если раствор содержит смесь веществ, частицы которых различаются по размеру, то на экспериментальной кривой наблюдается несколько пиков. Таким образом, возможно одновременно определять гомогенность образца по размеру частиц и молекулярную массу.

Частица, движущаяся с постоянной скоростью по окружности,, обладает ускорением, направленным к центру этой окружности. Это ускорение равно ?2?, где ? — угловая скорость вращения в радианах в секунду, а ?—радиус окружности в сантиметрах. Произведение массы на ускорение дает силу F

F=V(p2 — рх) (й*х--- Ург(й*х — Vpj(u2x

где V — объем частицы, а рг и pi — плотности частицы и растворителя соответственно (в граммах на миллилитр). Для 1 моля растворенного вещества

F — МаРх — MvfaaPx = ???? (1 — ??1)

где ? — молекулярная масса растворенного вещества, a ? — парциальный удельный объем в миллилитрах на грамм. Сила, проти-

¦128

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕГКИ

•водействующая центробежной силе F, равна f(dx/di), где dx/dt — •скорость седиментации, а /—молярный коэффициент трения. Тогда •справедливо

dx

f —jj- = ??2? (I — VP,) Преобразуя это выражение, получаем

dx 1

где -^- ¦ ^ — скорость седиментации в единичном силовом поле,

гназываемая коэффициентом седиментации 5.

Решая полученное уравнение относительно М, получаем

Из этого уравнения нельзя рассчитать молекулярную массу, поскольку коэффициент трения / неизвестен и не может быть легко измерен. Однако f связан с коэффициентом диффузии D (см2/с):

D = RT/f

тде R — газовая постоянная (8,31-Ю7 эрг-моль-1-град-1), а ? — абсолютная температура в Кельвинах. Таким образом, для молекулярной массы получаем

? = sRT/D (1 — vp)

В этом уравнении все величины могут быть определены экспериментально, и, следовательно, можно вычислить молекулярную .массу.

Коэффициент седиментации 5 имеет размерность времени, рас-•считывается на единицу силы и обычно составляет МО43— 200· Ю-13 с. Единица измерения коэффициента седиментации называется сведбергом (сокращенно обозначается S); 1S = 1 -10~13 с.

Коэффициент диффузии можно определить путем наблюдения за уширением первоначально резкой границы между раствором белка и растворителем по мере того, как молекулы белка диффундируют в зону растворителя.

Скорость седиментации зависит от разности плотностей растворенных частиц и растворителя. Если частицы имеют меньшую плотность, чем растворитель, они всплывают (как сливки в сепараторе). Парциальный удельный объем ? для большинства белков составляет 0,70—0,75 мл/г и зависит от аминокислотного состава; ?, можно вычислить, если последний известен, или определить экспериментально.

5. БЕЛКИ. II

129

^ i i и ? ¦ / 8* \ 1 Km/ i... ^Vi .

Рис. 5.3. Седиментация кристаллической рибонуклеазы в аналитической ультрацентрифуге при скорости вращения ротора 59 780 об/мин. Направление седиментации — слева направо. Первая фотография сделана через 1 ч после достижения установленной скорости; последующие-—через каждые 16 мин. Обратите внимание на то, что по мере продвижения границы ко дну ячейки, высота пика уменьшается, а ширина увеличивается. Это явление обусловлено диффузией. Граница у дна ячейки соответствует осажденному белку. Если препарат содержит смесь белков или других веществ, молекулы которых различны по размерам, наблюдается серия пиков.

Белки с высокой степенью очистки образуют индивидуальные пики при ультрацентрифугировании. В качестве примера