Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

аряды и находится в 1Ча+-форме. Ионы Na+ (1), связанные со смолой, быстро обмениваются с катионами натриевой соли (2) слабой кислоты ИВ (3); б — соединения РН+ (4) и QH+ (5), добавленные в систему, обмениваются с ионами натрия и оказываются связанными со смолой; в — сродство РН+ к смоле снижено увеличением .рН до 6, т. е. до р7( РН+; г — сродство РН+ и QH"1 к смоле ослабляется также при увеличении концентрации Na+.

154

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ K-iiifKH

:^Haruii^/'tiianiBwwtfq|jiwpего

Кислота

«1-

' И ft Ш

? 91 ? # w ?

-рН 4Д5,0,2и.и>,тРап1 натри*

» ТО « ИО »

л ^-колонка !5см;рН5,28;0,35н.——·{' цитрат натрия _У

Рис. 5.17. Автоматическая запись результатов хроматографического анализа стандартной смеси аминокислот на сульфированной полистнрольной смоле. [Spack-тап D. Н., Stein №. ?., Moore S., Anal. Chem.. 30, 1190, 1958.]

вать за сульфогруппы смолы. Следовательно, для того, чтобы разделить ? и Q в этой системе, нужно приготовить буфер с такими рН и концентрацией Na+, чтобы РН+ и QH+ имели различное сродство к иониту, тогда при пропускании смеси РН+ и QH+ через колонку произойдет разделение. Другие факторы, такие, как температура и присутствие органических растворителей, также влияют на хроматографическое поведение смесей ионных соединений. Очевидно, что подобный механизм процесса ионного обмена имеет место н на анионитах; только в этом случае фиксированные катионные группы носителя связывают анионы.

Ионообменная хроматография широко используется для разделения биомолекул. Примером, свидетельствующим о ее высокой разрешающей способности, является приведенная на рис. 5.17 картина разделения аминокислот. Для разделения требуются две колонки: одна (150 см) для кислых, нейтральных и ароматических аминокислот, а другая (15 см) для основных аминокислот. Очевидно, что удерживание аминокислот зависит от их основности. Поэтому аспа-рагиновая и глутаминовая кислоты выходят с колонки раньше большинства нейтральных аминокислот и, естественно, значительно опережают выход основных аминокислот. В этом случае легко могут быть разделены даже нейтральные аминокислоты, поскольку, несмотря на близкие значения рК, их неполярные боковые цепи обладают различным сродством к смоле. В системе, представленной на рис. 5.17, элюат, выходящий нз колонки, автоматически смешивается с раствором нингидрина; при прохождении аминокислоты с нингидрином через нагревательную ячейку появляется окрашивание, интенсивность которого

5. БЕЛКИ. II

155

¦ 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

ОСгъем элюагпа, мл

Рис. 5.18. Хроматографнческое разделение смеси белков ЗОБ-субъединнцы рибосомы Е. coli (гл. 26). Смесь нанесена на колонку (2,8X60 см) с фосфоцеллюлозой, уравновешенной фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 6 ? мочевину. Затем через колонку со скоростью 45 мл/ч пропущен буферный раствор с линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,6 моль/л. Фракции элюата собирались автоматически, концентрация белка определялась по поглощению пря длине волны 230 нм (Л2зо). Некоторые пики содержали индивидуальные белки; пики, обозначенные более чем одним номером, представляли собой смеси белков. [Hardy S. J. S., Kurland С. С, Voynow P., Mova С, Biochem., 8, 2897, 1967.]

определяется фотометрически. Изменение фототока с изменением объема элюата автоматически записывается самописцем на диаграммной ленте. Определение площадей пиков позволяет проводить анализ смесей количественно. Идентификация отдельных аминокислот осуществляется довольно просто, поскольку в контролируемых условиях параметры выхода с колонки постоянны для каждой аминокислоты. Все эти принципы были использованы прн конструировании аминокислотных анализаторов.

Разделение смеси аминокислот, приведенное на рис. 5.17, является примером ионообменной хроматографии при постоянной концентрации Na+ и трех различных значениях рН. Часто оказывается невозможным точно подобрать необходимые условия для удовлетворительного разделения неизвестной смеси ионов. По этой причине во многих случаях разделение на ионите проводят с помощью градиентного элюирования, при котором состав буферного раствора, поступающего в колонку, изменяют постепенно (либо относительно концентрации неорганического иона, участвующего в обмене с функциональными группами смолы, либо относительно рН), что приводит к изменению сродства растворенных веществ к иониту. На рис. 6.18 в качестве примера использования градиентного элюирования приведена картина разделения смеси белков.

5.6.3.4. Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация)

В этом виде хроматографии вещества разделяют в соответствии с размерами и формой их молекул. Если гранулы различных пористых нерастворимых материалов, таких, как синтетические смолы, пористое стекло или полисахариды (декстран или агароза), суспендировать в подходящем растворителе, то образуются две фазы растворителя (одна внутри, а другая вне гранул), как показано схематически на рнс. 5.19. Колонка, наполненная такими гранулами, дей-

166

[. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

самые крупные молекулы ((

I и го ?

средние молекулы (·)

1самые малые

I

Об"ьем

Рис. 5.19. Схематическое изображение процесса разделения трех веществ с различными молекулярными массами с помощью гель-фильтрации. Молекулы наименьшего размера могут свободно входить во внутреннее пространство частиц геля; более крупные молекулы также могут войти внутрь частицы, ио не столь легко, как первые. Самые крупные молекулы неспособны проникать внутрь геля. Светлые кружочки — частицы геля, а — смесь нанесена на колонку; б — процесс разделения прошел наполовину; в — самые крупные молекулы начинают выходить с колонки; г — кривые элюирования, полученные путем измерения концентрации вещества в каждой фракции собранного элюата после завершения хроматографии. Если Vo — объем растворителя между частицами геля, a Vs — объем доступного растворителя внутри геля, то объем элюирования Ve (объем, с которым данное вещество выходит с колонки) равен Ve=Vo-r-KVs (К — коэффициент распределения вещества между подвижной фазой Vo и неподвижной фазой Vs). Для веществ, не способных проникать в гель, Ve=Vo, поскольку для них К= = 0. Для веществ, способных входить в гель, Ve>Vo-. Ve=Vo+Vs для молекул, свободно проникающих в гель (К=1).

5. БЕЛКИ. II

157

2,6

2,4

2,2

2.0

1,8

1.6

1,0 0.8 0,6

- VI

0,4 -

20 30 40 50 Номер фракции

60 70 80

Рис. 5.20. Гель-фильтрация смеси олигосахаридов ?-ацетилглюкозамина. Смесь олигосахаридов в 0,1 ? NaCl нанесена на колонку; скорость элюирования 600 мл/ч. Объем каждой фракции 125 мл. Римские цифры у пиков указывают число остатков ?-ацетилглюкозамина в соответствующем углеводе (например, I — ?-ацетилглюкозамин, VI — хитогексоза). [Rafterу ?. ?., Rand-Meir Т., Dahl-quist F. W., Parsons S. M., Borders C. L. Wolcott R. C, Beranek W., Jao L., Anal.

Biochim., 30, 429, 1969.]

ствует как молекулярное сито, поскольку молекулы небольших размеров распределяются между обеими фазами, тогда как более крупные молекулы не могут проникнуть во внутреннюю фазу. Гранулированный материал можно подвергнуть химической обработке с целью получения определенной пористости и, таким образом, приблизительно определить молекулярные массы веществ, способных проникать внутрь гранул носителей. В табл. 5.5 приведены некоторые широко применяемые в гель-проникающей хроматографии молекулярные сита с указанием оптимальной области молекулярных масс.

Если на колонку с носителем, размеры пор которого исключают проникновение во внутреннюю фазу веществ с молекулярной массой выше заданной, нанести смесь растворенных веществ с различными молекулярными массами, то вещества с размерами молекул меньше заданного проникают во внутреннюю

153

Г. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Таблица 5.5

Некоторые носители, применяемые при гель-фильтрации

Тип носителя Молекулярные массы веществ, неспособных проникать во внутреннюю фазу носителя

Декстран >700

>1 500

1 000—5 000

. 1 500—30 000

4 000—If0 000

5 000—400 000

Агароза 1-10»—4-10«

5-104—20- 10е 20-???—40-106

фазу и отделяются от более высокомолекулярных (см. рис. 5.19). Некоторые вещества с незначительно отличающимися молекулярными массами могут быть легко отделены друг от друга; например, моно-, ди- н трисахариды легко отделяются от более высокомолекулярных олигосахаридов, как показано на рис. 5.20. Понятно, что способность молекулы" проникать во внутреннюю фазу зависит как от молекулярной массы, так и от формы молекулы, а в случае макромолекул форма часто оказывает такое же существенное влияние на реальный объем удерживания, как и их размер. Асимметричные молекулы могут оказаться неспособными проникать во внутреннюю фазу, легко доступную сферическим молекулам такого же размера, и поэтому могут элюироваться с колонки меньшим объемом, чем сферические молекулы.

5.6.3.5. Аффинная хроматография

Аффинная хроматография используется для выделения таких белков, как ферменты, иммуноглобулины, лектины, рецепторные белки, которые обладают способностью специфически связываться с другими веществами. Несмотря на то что этот метод разработан сравнительно недавно, он уже оказал мощное влияние на развитие методологии очистки белков. Принцип метода состоит в следующем: лиганд L, который обладает способностью специфически связываться с выделяемым белком, прочно закрепляют иа нерастворимом носителе М. Полученный таким образом адсорбент ML суспендируют в подходящем растворителе и переносят в хроматографическую колонку. Затем через колонку пропускают смесь, содержащую выделяемый белок. Белок ? связывается со специфическим адсорбентом благодаря нековалентным взаимодействиям:

М—L + ? <—>¦ ?—L- · ?

Если данная смесь не содержит других белков, способных связываться с иммобилизованным лигандом, то все белки, кроме Р, пройдут вниз по колонке не задерживаясь. После тщательной промывки колонки связанный белок элюируют раствором, вызывающим диссоциацию специфического комплекса,

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.11.2019)