Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

ичных аминокислот выражено в граммах на 100 г исходного белка; при суммировании получим, что на 100 г белка приходится ~118 г аминокислот (с учетом одной молекулы воды на каждую гидролп-зуемую пептидную связь). Если же при расчете содержания аминокислот учитывать массу аминокислотных остатков, а не свободных аминокислот, то суммарное содержание аминокислот в белке, не содержащем неаминокислотных компонентов, должно составлять 100%. Приведем пример такого расчета. При гидролизе инсулина образуется 8,6 г свободного фенилаланина на 100 г белка (табл. 6.1). В пересчете на массу аминокислотного остатка это составляет 8,6-147/165=7,7 г на 100 г белка, поскольку молекулярная масса фенилаланина 165, а масса остатка фенилаланина в белках 147.

При изучении структуры белка более информативен другой метод выражения данных аминокислотного анализа. Если известна молекулярная масса белка, то можно рассчитать число аминокислотных остатков в молекуле; оно должно быть целым, поскольку в белке не может присутствовать часть остатка. Эти значения также приведены в табл. 6.1.

Таблица 6.1

Содержание аминокислот в белке и число остатков, приходящееся на одну молекулу

Лмииаьнс. юта или другой определяем ый компонент Инсулин (быка) Рибоиу леаза (быка) Цитохром с (лошади) Гемоглобин (человека) Миоглобин (человека) Содержание аминокислот, % Число остатков Содержание аминокислот, % Число остатков Содержание аминокислот, % Число остатков Содержание аминокислот, % Число остатков Содержание аминокислот. % Число остатков

Алании 4,6 3 7,7 12 3,5 6 9,0 72 5,7 12

?? из амидов 1,7 2,1 1.1 0,9 1.1

Аргинин 3,1 1 4,9 4 2,7 2 3,3 12 2,7 2

Аспарагин 3 10 5 20 3

Аспарагиновая кис- 6,7 0 15,0 5 7,6 3 9,6 30 9,2 S

лота

Цистеин 0 0 1.7 2 1,0 6 0

Цистин 12,2 6 7,0 R 0 0 0

Глутаминовая кисло- 17,9 4 12,4 5 13,0 9 6,6 24 17,3 14

та Глутамин 3 7 3 8 7

Глицнп 5,2 4 1.6 3 5,6 12 . 4,2 40 6,3 15

Гистидин 5,4 2 4,2 4 3.4 3 ,9,8 38 8,2 9

Изолейцин 2,3 1 2,7 3 5,4 6 0 5,0 8

Лейцин 13,5 6 2,0 2 5,6 6 14,0 72 12,2 17

Лизин 2,6 1 10,5 10 19,7 19 9,6 44 16,1 20

Метионин 0 4,0 4 2,1 2 1,2 6 2,5 3

Фенил аланнн 8,6 3 3,5 3 4,5 4 7,3 30 6,2 7

Пролин 2,1 1 3,9 4 3,3 4 4.8 28 4,0 5

Серин 5,3 3 11,4 15 0 4,4 32 4,6 7

Треонин 2,0 1 8,9 10 8,4 10 5,2 32 2,9 4

Триптофан 0 0 1.5 I 1.9 6 3,6 о

Тирозин 12,6 4 7,6 6 4,9 4 2,9 12 2.4 2

Валин 9,7 5 7.5 9 2,4 3 10,3 62 5,3 7

Всего' 51 124 104 574 153

Суммарное содержание, превышающее 100%, объясняется присоединением воды (см. объяснения в тексте).

170

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

6.1.2. Субъединичная структура

Прежде чем анализировать последовательность аминокислот в белке, необходимо определить, содержит ли белок одну субъединицу (полипептидную цепь) или состоит из нескольких субъедиииц. Если обнаружено несколько субъединиц, следует установить, идентичны ли их аминокислотные последовательности и связаны ли они межцепочечнымн дисульфидными мостиками. Для получения необходимой информации особенно полезны методы определения молекулярных масс в различных условиях (гл. 5). В настоящее время обычно проводят седиментационио-равновесный анализ на ультрацентрифуге. Важно прежде всего определить молекулярную массу белка в его натнвной конформации, затем молекулярную массу белка в 6 ? растворе гуанидингидрохлорида, который денатурирует молекулу, разрушая ее третичную и четвертичную структуру. Если в обоих случаях получают одно и то же значение, то белок содержит либо единственную полипептидную цепь, либо две или более цепей, соединенных дисульфидными мостиками. Далее молекулярную массу определяют в присутствии смеси 6 ? раствора гуанидингидрохлорида и меркаптоэтанола, при этом в дополнение к разрушению третичной и четвертичной структур восстанавливаются дисульфидные мостики. Если все три метода дают одно и то же значение молекулярной массы, то значит белок содержит одну полипептидную цепь. Если же при определении в гуанидингид-рохлориде значение оказывается меньшим, но совпадает с найденным в смеси гуанидингидрохлорида и меркаптоэтанола, то, по-видимому, в белке содержится несколько субъединиц, не связанных дисульфидными мостиками. В этом случае молекулярная масса, определенная в растворе гуанидингидрохлорида, должна быть кратной молекулярной массе нативного белка, т. е. если она равна половине массы нативной молекулы, то белок, вероятно, содержит две субъединицы, если же одной четверти — четыре субъединицы и т. д. (при условии, что все субъединицы одинаковы по размерам). Если же в белке присутствуют субъединицы различных размеров, то проще всего убедиться в этом с помощью электрофореза в геле в присутствии додецилсульфата натрия (разд. 5.1.7). В качестве примера можно привести иммуноглобулины, которые содержат субъединицы совершенно разных размеров. В табл. -6.2 приведен ряд белков с известной субъединичной структурой, в ней же даны некоторые их структурные характеристики.

Данные по определению молекулярной массы сами по себе недостаточны для того, чтобы решить вопрос об идентичности всех субъединиц данного белка. Нативный гемоглобин имеет молекулярную массу 65 ООО; однако при определении молекулярной массы в денатурирующих условиях (как в присутствии, так и в отсутствие меркаптоэтанола) получают значение, приблизительно в че-

Таблица 6.2

NHVKoHneBbie остатки, число и тип дисульфидных мостиков и количество субъединиц в некоторых белках

Белок

Источник

Молекулярная масса

ЫНг-концевые остатки

Число S—s-связей

внутри-цепочечные

межцепочечные

Число цепей

Последовательности цепей субъединиц

Инсулин Поджелудочная железа быка* 5 700 1 Phe, 1 Gly 2 1 2 2 различные

11 100 1 Ala

Рибонуклеаза Т1 Aspergillus' 0 2 1

Цитохром с Сердце позвоночных* 12 400 1 Ацетил-Gly 0 0 1

Рибонуклеаза Поджелудочная железа быкаа 13 700 1 Lys 0 4 1

Трнпсиноген То же 24 400 1 Val 0 6 1

а-Химотрипсин » » 24 300 1 He, 1 Ala, ICys 65 000 4 Val 2 2 3 3 различные

Гемоглобин Эритроциты человека3 0 0 4 2 различные

Альбумин Сыворотка человека3 66 500 1 Asp 0 17 1 Алкогольдегидрогеназа Печень лошади3 80 000 2 Ацетил-Ser 0 0 2 Одинаковые

Гемэритрин Червь Sipunculid' Мышца кролика3 103 000 1 Gly 0 0 8 »

Глицеральдегнд-З-фос- HO 000 4 Val 0 0 4 »

фатдегидрогеназа 1Г0 000 См. гл. 30

Иммуноглобулин yG Человека 3 8 4 2 различные

Фибриноген Плазма человека 333 000 2 Ala, 2 Glu, Содержи ? как внут- 6 3 различные

2 Туг ри-, так чечные ные и межцепо-дисульфид-мостики

Фосфорилаза а Мышца кролика 370 000 4 Met 0 0 4 Одинаковые

Глутаматдегидрогеназа Печень быка* 336 000 6 Ala 0 0 G »

Синтетдза жирных Крысы 500 000 Неизвестно Не определено 2 Не определено

кислот

Вирус желтой мозаики 5 000 000 180 ?-Аце- 0 ? 180 Одинаковые

репы тил-Met

Аминокислотная последовательность установлена.

172

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

тыро раза меньшее, что свидетельствует о наличии в гемоглобине четырех субъединиц примерно одинаковых размеров, не связанных межцепочечными дисульфидными мостиками. Эти данные, однако, не дают никакой информации о том, идентичны ли аминокислотные последовательности всех четырех цепей гемоглобина, различны ли они или же имеется смешанный вариант.

Вопрос о том, одинаковы или различны аминокислотные последовательности субъединиц, можно выяснить путем определения числа пептидов в ферментативном гидролизате белка. Наиболее широко используемый для этой цели протеолитический фермент — трипсин, гидролизующий только те пептидные связи, которые образованы карбоксильными группами лизина или аргинина. По суммарному содержанию лизина и аргинина в белке можно примерно предсказать число триптических пептидов, которые должны образоваться при полном гидролизе трипсином. Для белка, состоящего из одной полипептидной цепи, число триптических пептидов равно числу остатков лизина и аргинина в молекуле плюс 1. Вдвое меньшее число пептидов образуется из белка, содержащего две субъединицы с одинаковой аминокислотной последовательностью. Пептиды разделяют на бумаге или других подходящих носителях (гл. 5), используя обычно электрофорез в одном направлении и хроматографию в другом с последующим обнаружением пептидов по реакции с нингидрином. Чрезвычайно маловероятно, чтобы два триптических пептида с различной аминокислотной последовательностью обнаружились в виде одного пятна. Более серьезные возможные осложнения обусловлены тем, что значительная часть триптических пептидов оказывается нерастворимой и не проявляется на пептидных картах, как это иногда случается при исследовании крупных белков. Обычно же число обнаруживаемых пептидов довольно близко к ожидаемому. Следовательно, метод пептидных карт в сочетании с определением молекулярной массы достаточен для того, чтобы выяснить, являются ли аминокислотные последовательности субъединиц одинаковыми или различными.

Анализ пептидных карт широко применяется при сравнении белков с весьма близкими структурами, отличающимися одним или несколькими остатками. Многие аномальные гемоглобины (гл. 31) отличаются от нормального одним единственным остатком. Пептид, содержащий такой остаток, обычно проявляет отличную от соответствующего пептида

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)