с помощью измерения скорости отщепления каждого следующего остатка; например, в белке с последовательностью-nh2—A-B-C-D... W-X-Y-Z—СООН при заданном времени гидролиза количество отщепленного ? всегда больше, чем ?, и т. д. Карбоксипептидаза А малоактивна или неактивна вовсе к СООН-концевым остаткам пролина, аргинина или лизина. Карбоксипептидаза В в отличие от карбоксипептидазы А отщепляет СООН-концевые остатки лизина и аргинина (табл. 6.3).

6.2. Определение аминокислотной последовательности

6.2.1. Общий подход

Допустим, что необходимо определить аминокислотную последовательность содержащего одну полипептидную цепь белка, молекулярная масса и аминокислотный состав которого известны и последовательность которого можно представить как

HjN—ABCDEF · ¦ · T-U-V-W-X-Y-Z—СООН

С помощью методов идентификации концевых групп уже определены NH2- и СООН-концевые остатки А и ? соответственно. Кроме

12—1148

178

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

того, посредством ступенчатой деградации по Эдману, возможно, определена даже 1МН2-концевая последовательность А-В-С и с помощью карбоксипептидаз идентифицирована последовательность X-Y-Z. Задача теперь состоит в том, чтобы выяснить оставшуюся часть аминокислотной последовательности белка. Общий подход -включает следующие стадии: 1) осуществление частичного гидролиза белка ферментами или химическими реагентами; 2) выделение полученных пептидов; 3) определение аминокислотных последовательностей этих сравнительно небольших фрагментов; 4) сборка полной аминокислотной последовательности из перекрывающихся пептидов.

Для определения полной аминокислотной последовательности -белка должны быть использованы по крайней мере два различных типа частичного гидролиза с тем, чтобы установить структуру бел-аа методом перекрывающихся пептидов. В качестве иллюстрации .ниже приведен некий гипотетический вариант расщепления поли-лептидной цепи; места расщепления белка одним ферментом, в результате которого образуются пептиды I—VI, показаны стрелками:

-HjN-A-B-C-D-E-F-G.....................? ¦ U · V · W ·?· ? · Z-COOH

? ? ? ? ?

г ? ?? ?? ? ??

Пептидам I и VI можно предварительно приписать их местоположение, если известны ??2- и СООН-концевые участки аминокислотной последовательности. Прямого способа определения положения пептидов II, III, IV и V не существует. Однако гидролиз белка другим ферментом приводит к совершенно иным пептидам, поскольку действие этого фермента направлено на другой набор пептидных связей (табл. 6.3). Предположим, получен пептид, имеющий аминокислотную последовательность C-D-E-F-G и т. д., которая перекрывается с последовательностями пептидов I и II, что позволяет установить их порядок. Аналогичным образом можно полностью восстановить всю аминокислотную последовательность белка.

Прежде чем приступить к использованию этих общих приемов, важно провести модификацию остатков цистина и цистеина в белке, поскольку эти остатки очень реакционноспособны по отношению к некоторым применяемым в структурном анализе реагентам; они подвержены взаимному дисульфидному обмену и плохо поддаются количественному анализу. Такая модификация легко осуществляется несколькими методами, включая восстановление меркап-тоэтанолом и затем реакцию с иодацетатом с образованием S-кар-

6. БЕЛКИ. III.

179>

боксиметильного производного белка (разд. 6.1.1). Можно применять окисление надмуравьиной кислотой, но только не для белковг содержащих триптофан, который разрушается в этих условиях.

6.2.2. Частичный гидролиз

Существуют два общих метода осуществления частичного гидролиза полипептидов и белков: 1) гидролиз, катализируемый про-теолитическими ферментами, и 2) расщепление химическими реагентами.

6.2.2.1. Действие протеолитических ферментов

Протеолитические ферменты катализируют ограниченное расщепление, в результате которого образуются с хорошим выходом относительно крупные фрагменты. Поскольку каждый пептид должен быть выделен в чистом виде, что обычно осуществляется с помощью хроматографических и электрофоретических методов (гл. 5), то чем меньше число фрагментов, тем проще проблема их очистки.

Каждый протеолитический фермент гидролизует пептидные связи только определенного типа. Например, трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, образованных исключительно карбоксильными группами лизина или аргинина. Каждый пептид, полученный в результате расщепления трипсином, за исключением, быть может, исходного СООН-концевого, должен оканчиваться остатком аргинина или лизина.

Другие протеазы, как, например, химотрипсин, папаин и т. д., гидролизуют белки или пептиды в других местах пептидной цепи. Специфичность некоторых протеолитических ферментов, доступных в чистом виде и наиболее широко применяемых в структурном изучении белков, приведена в табл. 6.3.

Действие некоторых протеолитических ферментов на окисленную В-цепь бычьего инсулина показано на рис. 6.2. Расщепление ферментами пепсином, химотрипсином или трипсином носит ограниченный характер и относительно специфично по сравнению с фактически беспорядочным частичным кислотным гидролизом.

Трипсин — фермент, чаще всего используемый для получения одного из двух наборов перекрывающихся пептидов, поскольку,, во-первых, он почти количественно расщепляет чувствительные к его действию связи; во-вторых, его можно получить свободным от примесей других протеолитических ферментов и, в-третьих, субстратная специфичность трипсина такова, что обычно обеспечивается образование пептидов, удобных по своим размерам для дальнейшего структурного анализа. Второй набор пептидов обычно получают с помощью химотрипснна или пепсина, которые дают, как

12·

aeo

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Phe-VaI-Asn-GIn-His-Uu-CyS03H-G^

р| ! I I m

t

-Arg-ay-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala

! I I

1 1

Рис. 6.2. Действие некоторых кристаллических протеолитических ферментов на Ъ-цепь окисленного инсулина. Сплошные стрелки указывают на основные места действия ферментов, штриховые стрелки—на другие связи, расщепляемые ферментами. В ходе окисления остатки цистина (CyS—SCy) были превращены в остатки цистеиновой кислоты (CyS03H). ? — связи, гидролизуемые пепсином, С — хи-жотрипсином, ? — трипсином. [Sanger F., Tupply Н„ Biochem. J., 49, 481, 1951.]

"правило, больше пептидов, чем трипсин, но полученные смеси обычно ие столь сложны, как при использовании папаина, термолизина или эластазы.

С целью расширения области применения фермент.ш разработано несколько приемов. Например, превращение остатков цистенна в S-аминоэтилцистеино-тые остатки при действии этилеиимина делает возможным расщепление трипсином связей этих остатков по карбонильным группам.

I I О ?? О NH

II I II I

—C-CH-CH2-SH + Н2С-СН2 -> —С—СН—СН2—S—СН2—CHjNHj

N

Остаток цистеина э ленимин остаток S-аминоэтилцистеина

Модификация лизина или аргинина может ограничить действие трипсина. Ацилирование ?-амнногрупп остатков лизина при нейтральных рН действием ¦малеинового или цитраконового ангидрида делает модифицированный остаток лизина устойчивым к трипсину, сводя протеолиз к расщеплению по остаткам .аргииина. р. \

JO ч И ? NH

НС-< NH Hr/C-N-(CH^-^

)о + н2ы-(сн2)4-сй /с=°

Малеинооый остаток лизина проЭцкт ацилирований

ангидрид

I

ЭДалеильная или цитраконильная группы легко снимаются при комнатной температуре под действием слабой кислоты (рН 2,5—3,0), затем трипсином могут <5ыть гидролизованы связи, образованные остатками лизина.

6. БЕЛКИ. Ш.

181

Аналогично этому остатки аргинина взаимодействуют при рН 8—9 с цик-логексаидионом (или другим дикарбонильным реагентом), образующим аддукт с гуанидиновой группировкой. Боратный комплекс с вицинальными гидроксид-иыми группами аддукта стабилизирует образованную структуру:

гуанидиновая группировка

Действие трипсина на обработанные таким образом полипептиды или белки сводится к гидролизу по остаткам лизина. Аргинин может быть регенерирован действием гидроксиламина, аммиака или другого нуклеофильного реагента при слабощелочных рН.

¦6.2.2.2. Специфическое химическое расщепление

Специфический химический метод расщепления по остаткам метионина основан на использовании бромциана (CNBr) в кислой среде, например в 90%-ной муравьиной кислоте:

О 90°?-ная муравьиная

R'-C-NH-CH-C-NH-R -> R'-

ком пая ^ тем е пу а

О CH.SCN

н2с I

Н3С—S + CN Вг

+

НВг

О

II

-С—NH—СН—С=0 + H,N—R I I 2

V "

?,

н2с

•СООН-Концевой остаток пептида теперь представляет собой лак-тон гомосерина. При гидролизе 6 и. НС1 в описанных выше условиях (разд. 6.1.1) происходит отщепление гомосерина и его лак-70на: NHj,

НО-СН2-СН2-С-СООН ?

гомосерин

пактом гомосерина

182

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Поскольку большинство белков содержит относительно небольшое число остатков метионина, метод очень удобен для получения больших пептидов.

6.2.3. Выделение пептидов

Пептиды, образованные при частичном гидролизе, могут быть разделены с помощью целого ряда методов, среди которых наиболее широко применяются гель-фильтрация, ионообменная хроматография и электрофорез на бумаге (гл. 5). Обычно только часть пептидов можно получить в чистом виде с помощью одного из этих методов; смеси пептидов, полученные при разделении одним из методов, должны быть подвергнуты дальнейшему разделению другим методом. Очистка больших гидрофобных пептидов часто вызывает затруднения, но в подобных случаях с успехом применялись такие методы, как гель-фильтрация в водных растворах кислот (например, в 50%-ной уксусной или муравьиной кислоте) или в растворах мочевины или гуанидингидрохлорида (от 2 до 8 моль/л). Благоприятным обстоятельством является доступность различных молекулярных сит, широко применяемых на практике для очистки пептидов (табл. 5.6).

6.2.4. Анализ последовательности аминокислот в пептидах

Аминокислотная последовательность небольших индивидуальных пептидов может быть определена с помощью метода гидролиза ферментами, отщепляющими NH2 и СООН-концевые остатки, в. сочетании со ступенчатым фенилтиогид