ота (лакгпимная форма)

HN С

Н

-?.

о=с

N ?

С=0

мочевая кислота (лактамнает форма) (2,6,?- триоксипурин)

Подобно пиримидинам, пурины склонны к лактим-лактамной таутомерии, показанной выше для мочевой кислоты. Лактимная форма мочевой кислоты является слабой кислотой (???=4,5; р/Сг = 10,3) и образует соли, такие, как одно- и двухзамешенные натриевые или калиевые ураты. Мочевая кислота и ее соли умеренно растворимы в воде. Это свойство лежит в основе последовательного осаждения уратов из мочи при стоянии (гл. 35).

Кофеин (1,3,7-триметилксантин) найден в кофе, чае и других растениях; теобромин (3,7-днметилксантин) встречается в чае и какао. Другие пурины также найдены в растениях, и некоторые из них, подобно кофеину н теобромину, обладают важными фармакологическими свойствами.

14—1148

210

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

7.1.3. Углеводы

Углеводом в РНК является D-рнбоза, которая находится в фу-ранозной гЬопме (гл. 2). Сахарный компонент ДНК—D-2-дезокси-рибоза.

TJ-рибоза (oC-D-рибофураноза) D- 2'- дезоксирибоза

(??-?-2'- дезоксирибофураноэа)

7.1.4. Нуклеозиды

Комбинация пурина или пиримидина с пентозой приводит к нуклеозиду. Аденин, связанный с рибозой, называется аденозином, гуанинрибонуклеозид — гуанозином и соответственно пиримидино-вые рибонуклеозиды — цитидином и уридином. Аналогичные нуклеозиды, образованные дезоксирибозой,— дезоксирибонуклеозиды: адениндезоксирибонуклеозид (или дезокси аденозин), дезоксицити-дин и т. д. Отметим, что дезоксирибонуклеозид тимина, который находится преимущественно в ДНК, называется тимидином, но не дезокситимидином. Тимин также встречается в одном из видов РНК, именуемой транспортной РНК (разд. 7.3.1.1). В этом случае используется название тиминрибонуклеозид или рибозилтимин.

Пуриновые нуклеозиды, полученные из РНК, имеют ?-гликознд-ную связь С-1' атома углевода с азотом в положении 9, как это показано для аденозина. Пиримидиновые нуклеозиды являются ?-1-гликозидами, как показано для цитиднна.

аденозин цитидин [9-B-D- рибофуранозил- (1ВР-рибофуранозил-аденин) цитозин)

7. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

211

Подобно О-гликозидам, такого рода ?-гликозиды стабильны в щелочах. Пуриновые нуклеозиды легко гидролизуются кислотой, в то время как пиримидиновые нуклеозиды гидролизуются лишь после достаточно продолжительной обработки концентрированной кислотой.

Нуклеозиды, содержащие дезоксирибозу, имеют тот же тип гликозидных связей и являются 9-?-?-2 -дезоксирибофуранозидами гуанина и аденина и 1^-о-2'-дезоксирибофуранозидами цитозина и тимина. Согласно номенклатуре нуклеозидов и их производных, номера атомов, помеченные штрихом, указывают на положение заместителей в углеводном остатке.

Свободный токсичный нуклеозид, небуларин (9-{5-Б-рибофуранозилпурин), выделен из гриба Agaricus nebularis. Это первое природное соединение, в котором пуриновое ядро имеет заместитель только в положении 9. Свободный пурин не найден в природных источниках. Среди других необычных нуклеозидов, встречающихся в природе, отметим антибиотики, некоторые из которых ингиби-руют белковый синтез (гл. 26).

7.1.5. Нуклеотиды

Как фосфорные эфиры нуклеозидов нуклеотиды являются сильными кислотами. Они называются, соответственно, адениловой, гу-аниловой, тимидиловой, цитидиловой и уридиловой кислотами.

Фосфорилирование сахарного остатка дезоксирибонуклеозида возможно только по положениям С-3' и С-5', так как атомы С-1' и С-4' включены в фуранозное кольцо, а атом С-2' не имеет гидроксидной группы. Оба типа замещенных фосфатов найдены в дезок-сирибонуклеозидах, выделенных после гидролиза ДНК- Ниже показано строение дезокси-З'-адениловой кислоты и дезокси-5'-аде-ниловой кислоты:

СН

NH2

)

СН

14*

212

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Дезокснгуаниловая, тимидиловая и дезоксицитидиловая кислоты, зтерифицированные в положениях 3' и 5', также обнаруживаются в гидролизатах ДНК.

В РНК только положения Г и 4' недоступны для этернфикацин, замещение же по С-2', С-3' и С-5' возможно. Щелочной гидролиз приводит к изомерным нуклеотидам, этерифнцированным по С-2' или С-3'. Ферментативный гидролиз может дать либо нуклеозид-З'-фосфаты, либо нуклеозид-5'-фосфаты. Значение различных изомеров нуклеотидов обсуждается ниже.

Все клетки содержат свободную форму аденнловой кислоты-— аденозин-5'-фосфат, а также полнфосфатные производные — адено-знн-5'-днфосфат и аденознн-5'-трифосфат. Аналогично широко распространены нуклеозид-5'-моно-, ?\?^???3??-5'-???- и нуклеозид-5'-трифосфаты других пуринов и пнрнмпдннов, являющиеся производными как рибозы, так и дезоксирнбозы. Некоторые нз этих моно-,

Таблица 7.1

Номенклатура и принятые сокращения для нуклеотидов1

Нуклеотид

Сокращение

Аденозин;?онофосфат (адениловая кислота)

Аденозиндифосфат

Аденозннтрифосфат

Гуанозинмонофосфат (гуаниловая кислота)

Гуанозиндифосфат

Гуанозинтрифосфат

Цитидинмонофосфат (цитндиловая кислота)

Цитидинднфосфат

Цитиднитрифосфат

Урндннмонофосфат (уридиловая кислота)

Уридиндифосфат

Уридинтрифосфат

Тиминрибонуклеозидмонофосфат (риботимидиловая кислота) Дсзоксиаденозинмонофосфат (дезоксиадсниловая кислота) Дезоксигуанозинмонофосфат (дезокснгуаниловая кислота) Тимидин монофосфат (тимидиловая кислота) Дезокснцитидинмонофосфат (дезоксицитидиловая кислота)

AMP

ADP

АТР

GMP

GDP

GTP

CMP

CDP

CTP

UMP

LDP

UTP

? ? ?

dAMP

dGMP dTMP

dC.MP

Приведена номенклатура только для 5'-замещенггых производных. Другие монофосфаты— З'-АМР, 2'-АМР, З'-GMP и т. д. ДополннтельнБ1е сокращения и символы см. в табл. 7.6 и в работе [J. Biol, chem., 245, 5171. 1970].

7. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

213

ди- и трифосфатов и принятые для них сокращения приведены в табл. 7.1. Роль этих соединений в процессах метаболизма обсуждается в части третьей.

В тканях, а также в некоторых нуклеиновых кислотах найден также продукт дезаминирования адениловой кислоты — инозиновая кислота (9-р-5'-фосфо-о-рибозилгипоксантин):

7.1.6. Методы исследования нуклеиновых кислот и их компонентов

7.1.6.1. Выделение нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты, присутствующие в тканях в качестве нуклеопротеи-новых комплексов с основными белками, могут быть выделены либо прямой экстракцией, либо путем экстракции соответствующих нуклеопротеинов, обычно 1 ? растворами солей. Растворимые нуклеопротеины диссоциируют при насыщении раствора хлоридом натрия, который при этом осаждает белки, а в случае ДНК—изопикническим центрифугированием нуклеопротеина (разд. 7.2.7). Белки могут быть также отделены от нуклеиновых кислот экстракцией фенолом или обработкой детергентами, такими, как додецилсульфат натрия. После отделения белка нуклеиновую кислоту можно осадить, медленно добавляя спирт.

7.1.6.2. Идентификация ДНК и РНК

Для определения типа нуклеиновой кислоты необходимо идентифицировать сахар. Наиболее часто применяемыми методами являются колориметрические; их можно использовать для количественного определения углеводов как таковых нли, соответственно модифицировав методику, для определения нуклеиновых кислот, нуклеотидов и других производных.

Некоторые из методов определения пентозы основаны на высвобождении фурфурола после нагревания с НС1 (разд. 2.2.6.3). Фурфурол дает красное окрашивание с ацетатом анилина или желтое окрашивание с л-бромфенилгидрази-ном. Рибоза дает характерную окраску после реакции с орцином в соответствующих условиях (табл. 2.1).

Если ДНК нагревать с дифениламином в кислом растворе, то наблюдается еннее окрашивание. При реакции Фойльгена (табл. 2.1) дезоксирибоза или ДНК после частичного кислотного гидролиза дают сине-фиолетовую окраску.

СН

ОН ОН

инозиновая кислота

214

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

7.1.6.3. Спектры поглощения

Циклические системы пуринов и пиримидииов в нуклеиновой кислоте содержат сопряженные двойные связи и обладают заметным поглощением в УФ-области спектра с максимумом поглощения вблизи 260 нм. Поскольку белки характеризуются гораздо более слабым поглощением в этой области (не более 1—2%), спектральные свойства нуклеиновых кислот удобны для идентификации и количественного определения этих веществ в клетках и тканях. Фотография клеток при УФ-освещении зависит в основном от сильного поглощения нуклеиновыми кислотами и позволяет, например, без прокрашивания изучать поведение хромосом в живых клетках. Применение такой методики в сочетании с использованием высокоочищенных ферментов, расщепляющих нуклеиновые кислоты или белки, позволяет точно локализовать нуклеиновые кислоты.

7.1.6.4. Разделение и анализ нуклеотидов

Для разделения пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов используются различные хроматографические методы. В случае нуклеотидов используется также электрофорез. Эти методы пригодны и для разделения производных рибозы и дезоксирибозы. Разделение нуклеотидов зависит от присутствия в пуринах и пиримидинах способных к ионизации групп, а именно енольных гидроксидных групп урацила, тимина н гуанина с ??' в интервале от 9 до 12,5 и аминогрупп аденина, гуанина и цитозина с рК' между 2 и 4,5. Кроме того, все нуклеотиды обладают двумя кислотными группами замещенной фосфорной кислоты с ??"? ~ 1 и ??? ~ 6.

7.2. Структура дезоксирибонуклеиновых кислот

7.2.1. Межнуклеотидные связи

Дезоксирибонуклеиновые кислоты являются полинуклеотидами, в которых фосфатные остатки каждого нуклеотида служат мостиками при образовании фосфодиэфирных связей между остатками дезоксирибозы. Доказательство того, что межнуклеотидные связи находятся между атомами С-3' и С-5', получено при изучении ферментативных гидролизатов ДНК. Последовательный гидролиз ДНК панкреатической дезоксирибонуклеазой (ДНазой) и фосфоди-эстеразой змеиного яда дает смесь дезоксирибонуклеозид-5'-фосфа-тов. Комбинированное действие ДНазы и фосфодиэстеразы селезенки приводит к дезоксирибонуклеозид-З'-фосфатам. Таким образом, ДНК является длинноцепочечным полимером с диэфирными межнуклеотидными связями между атомами С-3' и С-5', как показано на рис. 7.1 для фрагмента цепи ДНК.

Для построения схематической с