Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

еаза, инду- ДНК цируемая фагом ? Две 5'- Нуклеозид-5'-фосфаты и одноцепочечная ДНК

220

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ К ТЕТКИ

К цепи

Рис. 7.2. Размеры комплексов и длина водородных связей между тимином и аде-нином (а), цитозином и гуанином (б) в двойной спирали ДНК. [Wilkins ?. ?., Arnott S., J. Mol. Biol., 11, 291, 1965.]

ний с сахарофосфатным остовом, одинаковы для каждой пары (1,085 нм); эти связи симметрично ориентированы относительно оси второго порядка, расположенной определенным образом по отношению к плоскости пары. Таким образом, соединения между двумя C-l'-атомами на одном и том же уровне спирали могут быть образованы любой из четырех пар оснований А—?, Т—A, G—С или С—G. Типы водородных связей показаны на рис. 7.2.

Встречаются три сходные формы двуспиральных ДНК: А, В и С. В-форма, описанная выше, по-видимому, является обычной формой, найденной в растворе и in vivo. В-форма превращается в ?-форму, когда влажность препарата ДНК снижается до <;75%. ?-форма отличается от В-формы тем, что пары оснований не перпендикулярны оси спирали, а наклонены под углом ~20°. В результате шаг спирали уменьшается с 3,4 до 2,8 нм. В ?-форме имеется 11 пар оснований на виток, что приводит к укорачиванию цепи приблизительно на 25%. С-форма, очень сходная с В-формой, имеет шаг спирали 3,3 нм и 9 пар оснований на виток.

Две цепи ДНК не идентичны, но комплементарны, что означает спаривание соответствующих оснований (А с Т, G с С), как показано для гипотетического фрагмента двух цепей ДНК (где буквы означают дезоксирибонуклеозиды):

AGTCAAGTGCJCC

TCAGTTCACCGC

7. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

221

Рис. 7.3. Схематическое изображение двойной спирали ДНК- Две ленты изображают сахарофосфатную цепь, горизонтальные линии — связывание пар оснований, а вертикаль — ось спирали.

Направление цепей в отношении межнуклеотидных связей неодинаково, т. е. цепи антипараллельны. Если, например, в верхней цепи фосфодиэфирные связи между А и G, G и ?, ? и С и т. д. принадлежат к типу 5'—>-3', то в нижней цепи фосфодиэфирные связи между ? и С, С и А, А и G и т. д. принадлежат к типу 3'—>-5'. Обе цепи являются правовращающими спиралями, закрученными вокруг одной и той же оси. Модель, иллюстрирующая образование спирали из двух цепей, показана на рис. 7.3.

7.2.5. Синтетические полинуклеотиды

Известны полинуклеотиды, содержащие одни пли два вида нуклеиновых оснований. Они синтезируются энзиматически с помощью полинуклеотидфосфорилазы и РНК-полимеразы (гл. 26) в случае полирибонуклеотидов и с помощью ДНК-полимеразы I (гл. 25) в случае полидезоксирибонуклеотидов.

Когда полиадениловая кислота [poly(А)] смешивается с по-лиуридиловой кислотой [poly(U)], образуется аналогичная ДНК

222

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

двуспиральная структура с водородными связями между парами А и U. При определенных условиях могут образоваться и тройные спирали, состоящие из одной нити poly (А) и двух нитей poly(U). Дву- и трехспиральные структуры получены также из полиинози-новой н полицитидиловой кислот.

Синтетический полидезоксирибонуклеотид polyd(A-T) имеет двуспнральную структуру, в которой каждая цепь обладает определенной чередующейся последовательностью оснований -"dA--dT-dA-dT"-. Методом дифракции рентгеновских лучей установлено, что литиевая соль этого полинуклеотида существует в В-фор-ме с размерами спирали, идентичными размерам спирали литиевой соли ДНК. Как и ожидалось, ДНК, построенная только из остатков адениловой и тимидиновой кислот, имеет очень низкую температуру плавления Тпл (см. ниже). Аналогичный сополимер polyd(I-C) с чередующимися основаниями имеет размеры спирали и физические свойства, подобные polyd(A-T).

Простые полимеры с регулярной структурой, подобные описанным выше, найдены в центромерных областях хромосом эукариот (гл. 25). Их выделяли с помощью равновесного центрифугирования ДНК (из тканей животных) в градиенте плотности хлорида цезия; они обнаруживаются в виде сателлитной полосы низкой плотности. Один из сателлитов, присутствующих в ДНК некоторых видов крабов, по составу и последовательности аналогичен polyd (А-Т)-сополимеру с чередующимися основаниями. Он состоит приблизительно на 97% из последовательно чередующихся дез-•оксиадениловой и тимидиловой кислот; гуаниловые и цитидиловые -остатки (на которые приходится 3%) распределены по всей молекуле сателлитной ДНК. Аналогичные ДНК выделены из тканей многих животных.

7.2.6. Изменения в последовательности оснований. Мутации

Изменения в последовательности оснований ДНК называются мутациями и могут включать замещение, делецию или вставку одного или более оснований. Известны также инверсии или транслокации последовательности оснований. Среди различных видов мутаций наиболее распространено замещение одной пары оснований. Замещение может быть следствием ошибок в спаривании оснований в процессе синтеза ДНК (гл. 25). Такие ошибки спаривания могут быть вызваны изменением структуры основания, например таутомерным сдвигом от кето- к енольной форме в момент спаривания. Измененное основание может присутствовать либо в матрице ДНК, либо в поступающем для синтеза дезоксирибонуклеоти-де. Замещение имеет место, например, вследствие способности редкой лактнмной формы тимина давать пару с нормальной лактам-

7. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

223·

ной формой гуанина, что превращает пару гуанин — цитозин в пару аденин— тимин.

Некоторые аналоги оснований, например 5-бромурацил, также могут увеличивать частоту замещений, поскольку относительная доля лактимной формы увеличивается, и поэтому увеличивается степень ошибочного спаривания.

7.2.7. Плотность ДНК

Если концентрированные растворы хлорида цезия центрифугировать в аналитической ультрацентрифуге при высоких скоростях до установления равновесия между седиментацией и диффузией (гл. 5), создается стабильный градиент концентрации CsCl. Это со-, ответствует увеличению плотности раствора в направлении центробежной силы. Формируемый градиент плотности пропорционален центробежной силе в соответствии с уравнением ар[аг=аы2г, где ? — плотность, являющаяся функцией от радиуса г (расстояние от центра вращения), ? — угловая скорость и ? — константа, зависящая от природы соли. Если раствор CsCl содержит небольшое количество ДНК, то в условиях равновесия молекулы ДНК собираются в полосы в тех зонах ячейки для центрифугирования, где их плотность и плотность среды равны (изопикничны). Положение ДНК в ячейке может быть установлено по поглощению в ультрафиолетовой области, регистрируемому с помощью фотографии. Точно вычислив градиент плотности раствора вдоль ячейки, можно найти плотность образца ДНК. Эта техника называется изопикни-ческим центрифугированием в градиенте плотности. Плавучая плотность ДНК находится в эмпирической зависимости от содержания G-f-C в молекуле:

? (г/см3) = 1,660 + 0.100 (содержание G + С)

Это свойство позволяет фракционировать молекулы ДНК по содержанию в них G-f-C.

7.2.8. Денатурация ДНК

Кроме водородных связей поддержанию жесткой двуспиральной структуры способствуют гидрофобные силы между расположенными «стопкой» пуринами и пиримидинами. Реагенты, подобные фор-мамиду и мочевине, которые увеличивают сольватацию ароматических ядер молекулами воды, вызывают также денатурацию ДНК. По аналогии с действием целого ряда реагентов и условий, например кислоты, щелочи, нагревания и низкой ионной силы, изменение-структуры ДНК в этом случае можно объяснить тем, что первоначально прочная двуспиральная структура ДНК переходит в денатурированное состояние, для которого характерна гибкая одно-

224

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

цепочечная структура. Для оценки перехода от нативного состояния к денатурированному, как и для определения других свойств ДНК, существует ряд методов.

7.2.8.1. Поглощение в УФ-области

Все нуклеиновые кислоты сильно поглощают свет в УФ-области с максимумом ~260 нм. Когда нативность ДНК нарушается, наблюдается заметный гиперхротный эффект — увеличение поглощения. Это изменение отражает уменьшение числа водородных связей и отмечается не только для ДНК, но и для РНК и синтетических полинуклеотидов, которые имеют стабилизируемую водородными связями структуру.

7.2.8.2. Оптическое вращение

Нативная ДНК обладает сильным положительным вращением плоскости поляризации света, которое заметно уменьшается при денатурации.

7.2.8.3. Вязкость

Растворы нативной ДНК имеют высокую вязкость, что является следствием наличия относительно жесткой двуспиральной и вытянутой стержнеподобной структуры ДНК- Разрушение водород-пых связей приводит к заметному уменьшению вязкости.

7.2.8.4. Влияние температуры

Как отмечалось выше, нагревание образца ДНК в определенной ионной среде вызывает увеличение поглощения в УФ-областн и снижение оптического вращения и вязкости, отражая разрушение водородных связей между нитями двойной спирали.

Поскольку взаимодействия между основаниями двух цепей ко-оперативны, подобно взаимодействиям между молекулами в кристалле, упорядоченная спиральная структура разрушается в пределах небольшого температурного интервала, как это происходит при плавлении кристалла. По этой причине денатурацию двухце-почечной ДНК при нагревании часто называют «плавлением» ДНК, а температуру, при которой денатурировано 50% ДНК,— температурой плавления Тил.

Препараты ДНК из разных источников имеют различные Т„.ч, которые зависят от абсолютных количеств G + C и А+Т (рис. 7.4). Чем выше содержание G+C, тем выше температура перехода между нативной двойной спиралью и одноцепочечной формой (рис.

7. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

225

Температура, "С

Рис. 7.4. Кривые плавления образцов ДНК разного состава. [Doty Р., р. 8, in D. J. Bell, J. К. Grant (eds.), The Structure and Biosynthesis of Macromolecules, Biochemical Society Symposia, № 21, Cambridge University Press, New York, 1962.]

7.5). Это понятно, так как пары G—С могут образовывать структуру с помощью трех водородных связей, в то время как пары А— ? могут образовать только две водородные связи* (рис. 7.2). Определение значений Тпл при использовании для

страница 42
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)