|
|
Основы биохимии. Том 1?. ??2+ ?? О II I II H2N—С—NH—(CH2)4—CH—С—NH2 ос-бензои л - L- орнитинамиЭ оГ-бензоил-Ь-гомоаргининамиЭ Другие ферменты могут реагировать с различными соединениями и имеют, следовательно, относительно широкую субстрат- 9. ФЕРМЕНТЫ. II 283 ную специфичность. Примером является лейцинаминопептидаза, которая с различными скоростями гидролизует амиды многих аминокислот и дипептиды (табл. 9.1). Лейцинаминопептидаза катализирует реакцию ??2 О ?" ? -С—NHR' + ?,? + Н+ ??,*- I 3 R—С—СОО- + +H3NR* I 3 ? где R — боковая цепь аминокислоты, а Р/ — либо атом ? (в амидах), либо другая аминокислота (в дипептидах). Субстрат должен иметь незамещенную аминогруппу и атом водорода у ?-углерода, соседнего с атакуемой пептидной или амидной связью; ?-концевой остаток должен иметь l-конфигурацию [за исключением глицина, производные которого являются, однако, плохими субстратами (см. табл. 9.1)]. Таблица 9.1 Относительные скорости гидролиза различных субстратов лейцинаминопептидазой Субстрат Относительная скорость Субстрат Относительная скорость L-Лейцинамид 100 и-Лейнил-С-ленцин 100 L -Фенилаланинамид 26 L-Лейцил- L.-изоленцин 64 Ц-Изолейцинамид 20 L -Л ейцил-Ь-аланин 64 Ц-Гистидинамид 19 Ь-Лейцил-Ь-фенилаланин 26 L-Лизинамид 7,1 1..-Аланил-1--лейцин 93 L-Алаиинамид 3,4 L -Аланилглицин 9,4 L-Аспарагиновой кислоты 2,9 Глицил-L -лейцин 10 диамид Глнцилглицин 1,1 L-Серинамид 0,8 D-Лейцилглицин 0 L.-Пролинамид 0,7 Ацетил-Ь-тирозипамид 0 Глицинамид 0,1 а-Бензоил-ь-аргининамид 0 D-Лейцинамид 0 ?-Аланинамид 0 Скорость для лейцинамида условно принята за 100, для остальных субстратов приведены относительные скорости. Фермент выделен из почек свиньи; определения проведены с ферментом, активированным Мп-+ при рН 8,0—8.5. \Delange R. /., Smith ?. ?., p. 81, in: P. Boyer. ed.. Enzymes, vol. Ill, Academic Press. Inc. 1971.] Рассмотренные выше примеры иллюстрируют ряд аспектов субстратной специфичности ферментов. При взаимодействии суб- 284 II. КАТАЛИЗ страта и активного центра имеет место пространственная, или стерическая, специфичность. Это положение было сформулировано в 1935 г. Бергманом и сотр., которые, объясняя способность лейцинаминопептидазы гидролнзовать L-лейцилглицин, но не d-лейцилглицин (табл. 9.1), убедительно полагали, что взаимодействие фермента с субстратом должно осуществляться по крайней мере в трех точках. Это поясняется на приводимой ниже схеме: СО—??—СН2—СОО Ь {+?3?—С—? Ъ {н—С—NH/ СН2 СН2 I I ,сн СН .СНз СН;, СН3 ХСН3 L- лейцилглицин D- лейцилглицин Если а, Ъ и с — участки активного центра фермента, комплементарные указанным группам l-лейцилглицнна, и если приведенная пространственная ориентация необходима для связывания и последующего катализа, то очевидно, что невозможно ориентировать в пространстве те же самые три группы d-лейцилглнцина, чтобы они взаимодействовали с участками а, Ь и с. Эта концепция полиаффинности была подтверждена относительно недавно кристаллографическим анализом фермент-ингибиторных комплексов; ее иллюстрацией может служить также стереоспецифичность трипсина и фумаразы. Скорость превращения субстрата зависит от размера и строения групп субстрата; об этом свидетельствуют не только неспособность соединений, содержащих d-аминокислоты, служить субстратами лейцинаминопептидазы, но также и различие в скоростях гидролиза амидов лейцина и изолейцина. Столь же впечатляющей является неспособность трипсина гидролнзовать ?-?-бензоилпроизводные ь-орнитинамида и ь-гомоаргинин-амида. Связывание субстратов с комплементарными участками активного центра осуществляется за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий и водородных связей; однако некоторые ферменты образуют ковалентные интермедиа™ (такие примеры встречаются далее). Скорость гидролиза амидов (табл. 9.1) лей-цинаминопептидазой зависит от природы R-группы: она увеличивается в последовательности Н<СНз<С2Н5<СзН7<С4Нд. Наличие в R-группе полярных или ионных структур, таких, как ·—СОО-, —NH3 , —CONH2 и —СН2ОН, снижает скорость гидролиза. Основываясь на этом, можно предположить, что между R-группой суб- 9. ФЕРМЕНТЫ. II 28&» страта и комплементарной гидрофобной областью активного центра осуществляется гидрофобное взаимодействие. Такие представления подтверждаются данными о том, что алифатические спирты являются ингибиторами фермента (по-видимому, в результате конкуренции с R-группами субстрата за взаимодействие с гидрофобной зоной активного центра). В связывании субстратов участвуют также и электростатические взаимодействия; на это, в частности, указывают данные о том, что эфиры фумарата и малата не являются субстратами фумаразы. Другой пример — неспособность сукцинатдегидрогеназы действовать на замещенный по одной из карбоксильных групп сукцинат или фумарат (например, на монометиловый эфир сукцината). Это находится в согласии с данными о том, что конкурентные ингибиторы дегидрогеназы содержат по крайней мере одну карбоксилатную группу и что наиболее эффективными ингибиторами являются соединения с двумя незамещенными карбоксилатными группами (разд. 8.5.1). Положительный заряд на ?-аминогруппе лизина или гуанидиновой группе аргинина необходим для субстратов трипсина; кристаллографические исследования показывают, что R-группы субстрата локализуются в активном центре таким образом, что катионные амино-и гуанидиновая группы оказываются в непосредственной близости от анионной карбоксилатной группы боковой цепи остатка ас-парагиновой кислоты фермента. Наиболее убедительные свидетельства множественности взаимодействий, осуществляемых между ферментом и субстратом, получены при сравнении структур ферментов и их комплексов с ингибиторами (по данным кристаллографических исследований); эти данные обсуждаются ниже к этой главе. 9.2. Механизмы увеличения скоростей катализируемых ферментами реакций Один из главных вопросов биохимии заключается в следующем, каким образом ферменты ускоряют химическую реакцию? Многие факторы ответственны за такое ускорение, которое, как обсуждалось выше (разд. 8.1.6), является в конечном счете результатом, снижения энергии активации катализируемых реакций. 9.2.1. Увеличение скорости и субстратная специфичность Для различных типов химических реакций, катализируемых ферментами, известны аналогичные реакции в органической химии. Однако уникальным свойством ферментов является их субстратная специфичность. Характер действия многих ферментов 286 II. КАТАЛИЗ указывает на то, что специфическая энергия многоточечного связывания, осуществляемого между комплементарными группами субстрата и активного центра, используется в качестве движущей силы катализа и вносит значительный вклад в снижение энергии активации процесса, т. е. приводит к значительному его ускорению. Значение специфичности отчетливо проявляется при сравнении скоростей гидролиза ряда субстратов лейцинаминопептида-•зой (табл. 9.1). Эффективность гидролиза субстрата зависит в первую очередь от гидрофобности R-группы ?-концевой аминокислоты, которая участвует в образовании атакуемой амидной или пептидной связи. Другим примером может служить действие фосфоглюкомутазы {гл. 15), которая катализирует обратимую реакцию GC-D-r.TK>K030-l -фосфат < > «-D-глюкозо-б-фосфат Эта реакция протекает только в присутствии Mg2+ и глюко-.30-1,6-дифосфата; в ходе реакции образуется промежуточное соединение— фосфорилфермент, фосфатная группа которого (связанная с определенным остатком серина в молекуле фермента) обменивается с фосфатными остатками субстрата н глюкозо-1,6-дифосфата: ?—ОН -f- глюкозо-1,6-дифосфат < * ?—О—Р0|_ + глюкозо-1 (или 6)-фо;фаг В результате этой реакции происходит взаимопревращение фосфатных эфиров. Фосфорилфермент стабилен в водных растворах, но реагирует с различными соединениями типа ROH (табл. 9.2) согласно реакции ?—О—Р0|- + ЕОН -> Е—ОН + ROPO|- Сравнение скоростей фосфорилирования различных субстратов позволило выяснить ряд интересных аспектов, характеризующих связывание субстрата и каталитическую эффективность. Перенос •фосфорильной группы с фермента на воду (гидролиз фосфорнлфермента) протекает очень медленно, со скоростью лишь в ~60 раз большей, чем скорость неферментативного гидролиза серии-фосфата. В то же время фосфит и- ксилозо-1-фосфат, не являющиеся субстратами, ускоряют перенос фосфата фосфорнлфермента на воду в 580 и 1,7-105 раз соответственно. Это показывает, что реакционноспособность фосфорильной группы фосфорнлфермента значительно увеличивается в присутствии соединений, структурно сходных с субстратами и способных, следовательно, связываться ¦с активным центром (фосфит связывается на участке фосфата, .а ксилоза — на участке сахара). Ксилоза фосфорилируется фосфо-рилферментом значительно быстрее, чем вода; в присутствии же фосфита она фосфорилируется с образованием кснлозо-1-фосфата в 2-109 раз быстрее, чем вода.; наблюдаемая скорость лишь в 9. ФЕРМЕНТЫ. 11 287 Таблица 9.2 Относительные скорости фосфорилирования ряда соединений фосфорилферментом (фосфоглюкомутазой )а Субстрат НОН О тпноси тельная скорость" Субстрат ROH Отпиоситп е льная скорость ? нон нон ( » ) фосфит нон oC-D- ксилозо-1-фосфат у?" чА он] ? он н он D-нсилоза ? J40H ну[ (+-0-Р-0-) HO\j l/?? oh D-ксилоза 1,7 ¦ ??5 7 · ??4 2 ¦ 10s ??? ???,-- CH, сн, Yh,—сн, НО. СН=СН ОРО,2- хсн, сн, НОч СН СН,ОРО,г- сн, сн ноч ???,2 сн, с=с—сн/ но ОГО/ сн,—сн,—О—сн сн.,—он СН.ОН -оч ? он н н он ос- D- глюко зо - 1-фо ссрат 2 ¦ 105 4,4 ¦ 105 1,4 . 106 4,4 ¦ 10г 9 - 10* 3 . 10"" а Скорость фосфорилирования воды условно принята равной единице, для остальных соединений приведены относительные скорости. Константа скорости первого порядка фосфорилирования воды фосфорилферментом при 30 °С и рН 7.5 равна 3.2-10-* с—1. \/encks W. Ft.. Adv. Enzymol.,43, 219, 1975.] 15 раз меньше скорости фосфор |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 |
Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |