Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

тпил- 2,3,4,6 -О-глеглраметил-

JJ-J1- глюкопираноза oc-D-глкжопираноза

Кислоты и основания ускоряют мутаротацию; если любой из ано-меров растворить в бензоле н добавить смесь фенола и пиридина, то мутаротация происходит очень быстро. Изучение кинетики реакции показывает, что скорость процесса зависит от концентраций фенола, пиридина, а также тетраметилглюкозы; это позволяет сделать вывод, что фенол и пиридин действуют совместно как кислотный и основной катализаторы. Далее установлено, что если функциональные группы фенола (кислотную) и пиридина (основную) ввести в одну молекулу, как это имеет место в случае а-пи-ридона (?-оксипиридина), то образуется значительно более эффективный катализатор, хотя каталитические группы в ?-пиридоне являются существенно менее сильными, чем в феноле и пиридине, по своим кислотным и основным свойствам. Полагают, что катализ мутаротации ?-пиридоном протекает следующим образом:

р-аномер ог-аномер

При раскрытии пиранозного кольца ?-аномера интермедиат получает протон от атома азота (кислота), а карбонильный кислород (основание) акцептирует протон. Далее при замыкании кольца с

294

И. КАТАЛИЗ

образованием ?-аномера атом азота акцептирует протон от ин-термедиата (с раскрытым кольцом), а фенольный гидроксил поставляет протон. Установлено, что такой согласованный общий кислотно-основной катализ осуществляется при функционировании ряда ферментов, в частности рибонуклеазы (разд. 9.3.2). Маловероятно, что в результате катализа такого типа скорость реакции увеличивается более чем в 10—100 раз, однако наряду с другими механизмами он может вносить определенный вклад в увеличение скорости ферментативных реакций.

Многие аминокислоты могут функционировать в качестве общих кислотно-основных катализаторов в активных центрах фер-.ментов; к числу таких аминокислот относятся глутаминовая и ас-парагиновая кислоты, гистидин, лизин, тирозин и цистеин. В про-тонированной форме они являются кислотными катализаторами, •а в непротонированной форме — основными катализаторами (разд. 5.2). Очевидно, что каталитическая эффективность R-групп'. этих аминокислот зависит от р/С соответствующей функциональной группы и от рН, при котором протекает ферментативная реакция.

9.2.6. Ковалентный катализ

Некоторые ферменты, образующие ковалентные фермент-субстратные интермедиаты, перечислены в табл. 9.4, где указаны также группы ферментов, которые подвергаются ковалентной модификации, и характер структуры ковалентного интермедиата.

Одним из первых ферментов, для которого было показано образование ковалентного фермент-субстратного интермедиата, является химотрипсин; при действии этого фермента на л-нитрофе-нилацетат происходит быстрое освобождение л-нитрофенола и последующее значительно более медленное освобождение ацетата. Наблюдаемую кинетику процесса удалось объяснить, когда был выделен и охарактеризован ацилферментный интермеднат, устойчивый при низких рН. Установлено, что ацетилирование происходит по гйдроксидной группе серина-195 фермента. Таким образом, гидролиз л-нитрофенилацетата протекает по крайней мере в три стадии:

? + п-нитрофенилацетат

Е- · - п-нитрофенилацетат

Е- · · + я-нитрофенилацетат

ацетил—? + я-нитрофенол

ацетил—? -f- Н20

ацетат + ?

Первой стадией является образование комплекса Михаэлиса, второй— ацилирование, приводящее к образованию ковалентного ин-

9. ФЕРМЕНТЫ. II

295

Некоторые ферменты,

Таблица 9.4

образующие ковалентные фермент-субстратные интермедиаты

Реагирующая группа Тип ковалентного

Группа ферментов интермедиата

1. Химотрипсин, трипсин, субтилизин, эластаза, тромбин, ацетилхолинэстераза, плазмин

2. Фосфоглюкомутаза, щелочная фосфатаза

3. Папаин, фицин, глице-ральдегид-З-фосфат-де-гидрогеназа

4. Сукцинаттиокиназа, глю-козо-6-фосфатаза

5. Альдолаза, трансальдо-лаза, пиридоксальфос-фатзависимые ферменты

НО—СН2—СН

/

сн

\

серин

но-сн2—сн

серии

/ сн

\

HS—сн2—сн

/

сн

\

-СН2—сн

?? N

гистидин

/

сн

\

/

H2N—(СН2)4—СН

лизин

о

II / R—С—О—СН„—СН

\

эфир карболовой кисчоты

о

II / -О—Р—о—СН2—СН

I \ о-

зфир фосфорной кислоты

о

II / R—С—S—СН2—СН

\

тиоэфир ка боновой кислоты

/

0 ^^^СН,—сн О"—?—? ? ?

1 \У о-

фосфорилимндазол

R

I / R—C=N—(СН2)4—СН

\

шиффово основание

термедиата и освобождению первого продукта, и третьей — гидролиз интермедиата и освобождение второго продукта.

У протеолитических ферментов папаина и фицина в образовании ковалентного интермедиата (с фрагментом субстрата) участвует тиоловая группа цистеина, при взаимодействии которой с карбоксильной группой расщепляемой пептидной связи образуется тиоловый эфир; процесс гидролиза протекает по следующей схеме:

О О

II II E-SH+R-C—NH-R' > E-S—С—R + H2N—R'

о о

II II е—S— С—R + Н,0 ц.—*¦ Е—SH + R—С—ОН

296

It. КАТАЛИЗ

Другой тиоловый фермент — глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназа (гл. 14), катализирующий окисление альдегидного субстрата, глицеральдегид-3-фосфата, образует «богатый энергией» тиоловый эфир (по SH-группе активного центра). Образовавшийся ковалентный ацилтиоэфир подвергается фосфоролнзу, давая ацнл-фосфат, который сохраняет энергию ацнлтиоэфирной связи ковалентного интермедиата.

Другой формой ковалентного связывания субстратов является образование шиффовых оснований (альднминов) между карбонильными соединениями (субстратами) и ?-аминогрунпой лизина, находящегося в активных центрах ряда ферментов. Так, при инкубации диоксиацетонфосфата с альдолазой (гл. 14) в отсутствие глицеральдегид-3-фосфата (обычного партнера в реакции, катализируемой альдолазой) происходит следующая реакция:

сн„он сн,он

I I ?—(сн2)4—nh2 + 0=с ч=*Е—(сн2)4—n=c

сн2ОР03н2 сн,ОР03н2

Образование ковалентного соединения было доказано путем восстановления альдиминной двойной связи и последующего полного кислотного гидролиза модифицированного фермента. В гидролнза-те был обнаружен модифицированный лизин; его ?-аминогруппа была связана (в форме вторичного амина) с углеродным скелетом диоксиацетонфосфата. Подобные же результаты получены и с другим ферментом — трансальдолазой (гл. 14). Образованием шиф-фова основания можно объяснить наблюдаемую в фосфодиокси-ацетоне лабилизацию водорода у углерода, соседнего с карбонильной группой

сн,он нсон

I * ¦

—n=c <—*- —?—с

I I I

сн,0Р03н2 н сн,оро3н,

В этой связи представляет интерес рассмотрение функций пиридоксальфосфата в аминотрансферазах, механизм действия которых обсуждается детально в гл. 20. Следует только отметить, что альдегидная группа пиридоксальфосфата, участвующая в переносе аминогруппы, образует шиффово основание с ?-аминогруппой лизина апофермента. Это не только способ связывания пиридоксальфосфата с ферментом (связывание осуществляется и другими участками молекулы пиридоксальфосфата), но прежде всего путь ускорения ферментативной реакции, поскольку процесс тран-сальдиминирования является значительно более быстрым по сравнению с процессом образования шиффова основания. Схема полуреакции ферментативного переамипирования приведена на рис. 9.1.

9. ферменты. II

297

Важным преимуществом механизмов, включающих стадию образования ковалентных субстрат-ферментных интермедиатов, является избирательное увеличение вероятности протекания определенной реакции. Ковалентно связанный интермедиат обладает лишь весьма ограниченной подвижностью в активном центре фермента и может, следовательно, занимать более благоприятное положение для завершающей реакции с соответствующими группами активного центра. Кроме того, при функционировании ряда ферментов, таких, как глнцеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и сукцннат-тиокиназа, при образовании продукта используется энергия ковалентного интермедиата. Увеличение скорости реакции в результате образования ковалентных интермедиатов может быть весьма значительным (как, например, для альдолазы и трансами-назы), однако в .других случаях фактор ускорения не превышает 102—103.

9.3. Природа активных центров и механизм действия ферментов

Для идентификации функциональных групп активных центров, установления характера взаимодействия между субстратом и фер-

R R

-соо-

нс"

?? ?

г,нс—соо-

?—?*

н

НС—coo-

Рис. 9.1. Предполагаемая схема катализа полуреакции ферментативного переами-иироваиия: альдиминная структура, не участвующая в образовании водородных связей, осуществляет взаимодействие с аминокислотой — субстратом, а освобождающаяся е-аминогруппа лизина может функционировать в качестве кислотно-основного катализатора процесса переноса электронов, инициируемого пиридокса-лем. [Snell ?. ?., Brookhaven Symp. Biol. 15, p. 39, Brookhaven National Laboratory,

Upton., N. Y., 1962.]

298

II. катализ

ментом, а также вероятного механизма действия фермента используют различные экспериментальные подходы. Очевидно, что значительную информацию дает сравнение полной трехмерной структуры фермента в отсутствие и в присутствии ингибиторов. Такая информация может быть получена только на основании совокупности данных реитгеноструктурного анализа и полного определения аминокислотной последовательности; подобную информацию для ряда ферментов получить весьма нелегко. Для всесторонней интерпретации данных о структурах, полученных кристаллографическими методами, часто оказывается необходимым использовать другие экспериментальные подходы. Значительную информацию о ферменте и механизме его действия дает исследование субстратной специфичности и природы ингибиторов, а также кинетический анализ зависимости каталитической активности от рН, температуры и состава раствора. Существенным дополнением служит также изучение влияния на активность фермента действия) химических реагентов, которые ковалентно модифицируют специфические R-группы фермента, или протеолитических ферментов, специфически расщепляющих одну или несколько пептидных связей.

Ниже будут рассмотрены четыре различных гидролитических фермента (химотрипсин, рибонуклеаза, лизоцим и карбоксипепти-дрза А); их изучение может служить примером использования различных экспер

страница 56
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)