Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

ре связывания виртуальных субстратов, как это видно на рис. 9.5. Сходные структурные и функциональные характеристики представителей рассматриваемого класса ферментов отражают их

Рис. 9.6. Предполагаемая последовательность стадий при катализе, осуществляемом хипотрипсином и родственными ему сериновыми протеиназами. В каталитическом центре функционирует система переноса заряда (а), включающая аспара-гиновую кислоту, гистидин, серии, которые связаны водородными связями. Анион (гидроксидной группы серина) осуществляет нуклеофильную атаку углерода расщепляемой пептидной связи субстрата; образуется ацилфермент и освобождается аминный продукт (б). Гидролиз ацилфермента (в) возвращает активный центр

в исходное состояние (г).

20—1148

306

II. КАТАЛИЗ

общее генетическое происхождение (гл. 27). Природа, однако, использовала такой же тип каталитического центра (система переноса заряда) у другого протеолнтпческого фермента — субтилизи-на, который функционально сходен с химотрипсином, однако имеет совершенно другую последовательность аминокислот и другую конформацию. Тем не менее аминокислотная последовательность субтилизнна позволяет полинептидиой цепи свернуться таким образом, что образуется система переноса заряда, геометрически подобная соответствующей системе в хпмотрнпсиие (рис. 9.4).

9.3.2. Рибонуклеаза

Бычья панкреатическая рибонуклеаза, как было рассмотрено выше (разд. 7.3.1), гидролизует РНК; ее аминокислотная последовательность приведена на рис. 9.7. Еще до установления трехмерной структуры фермента, когда была известна только его аминокислотная последовательность, серия интересных исследований позволила получить значительную информацию об активном центре и механизме действия рибонуклеазы.

В определенных условиях субтилизин гидролизует в рибонук-леазе одну пептидную связь, находящуюся между 20-м и 21-м остатками. Фрагмент, содержащий остатки с 1-го по 20-й (S-nen-тид), остается в комплексе с крупным пептидным фрагментом, содержащим остатки с 21-го по 124-й (S-белок); расщепленный фермент сохраняет активность. После отделения S-пептнда от S-белка путем фракционирования при кислом рН ни S-пептид, ни S-белок не обнаруживают активности. Если же смешать S-пептнд и S-белок при рН 7,0, то они образуют активный комплекс—РНазу-S. S-Пептид связывается с S-белком не дисульфидными связями, а благодаря сильным нековалентным взаимодействиям. Рассмотренные данные отражены на приводимой ниже схеме; в кружке показаны остатки гистидина-12 и гистидина-119:

S-nenmyi9

S-белок

Синтетический пептид, идентичный по последовательности фрагменту S-пептнда, содержащему остатки с 1-го по 13-й, способен взаимодействовать с S-белком; при этом восстанавливается ~70% активности РНазы-S; однако пептид, являющийся более коротким фрагментом S-пептида (остатки с 1-го по 11-й), не вое-

10

11

12

13

14

15

17

18

19

20

4 3 2 1

54

53

52

51 50

Ala—Ala—Lys—Phe—Glu—Arg—-Gin ——His—Met—-Asp—-Ser—-Ser—>Thr —Ser—Ala—Ala

Ala t

Thr t

Gju Lys

IslHi

55

Gin—Ala—Val—Cy, Val ^

t

Asp t

Ala t

Leu I

Ser

Cys —Tyr—Gin —Ser—Tyr-

-Ser ¦

80

>Thr —Met—Serv/4

-ч I

Thr Asp

115 116 117 118 119 120 121 122 123 124

HOOC

, -Val-Ala—Cys—Glu—Gly— Asn—Pro—Tyr-Val-Prc—Val-His—Phe—Asp-Ala*Ser*Val lie _

•Iе (

100

His

94

90/

Hi Cy

ier

ii

Ser

J

ber

?

Asn Tyr

J

Cys

Arg

Glu

Tnr t

Gly

Lys* Asn — Ala-*- Gin— Thr— Thr—Lys—Tyr*Ala* Cys — Asn —Pro—Tyr—Lys—Ser* Ser

Asn *

Gin »

Met *

Met Lys

21 22 23

24 25

26 27 28 29 30 31

32.

49\^Uw_His^- Val*- Phe*. Thr*- Asn *- Val*- Pro— Lys*- Cys— Arg*-Asp*Lys—Thr- Leu—Asn^-Arg^y

48 47 46 45 44 43 42 t 41 40 39 38 37 36 35 34 ?3

Рис 9 7. Аминокислотная последовательность бычьей панкреатической рибонуклеазы. [Smyth D. С, Stein W. ?.,

Moore S., J. Biol. Chem., 238, 227, 1963.]

303

II КАТАЛИЗ

станавлнвает активности. Эти данные показывают, что либо His-12, либо Met-13, либо оба эти остатка играют ключевую роль в РНазной активности, в то же время остатки с 14-го по 20-й непосредственно не участвуют в формировании активного центра. Получены данные о важной роли ряда других остатков для активности фермента. Пепсин расщепляет пептидную связь между 120-м и 121-м остатками; фермент, лишенный остатков 121 —124, оказывается неактивным. Если отщепить карбокенпентидазой А от S-белка Val-124, то после рекомбинации с S-пептидом активность РНазы-S полностью восстанавливается; при удалении Ser-123 и последующей рекомбинации активность снижается на 55%; при более глубоком действии карбоксипептидазы А, приводящем к отщеплению нескольких следующих остатков, включая Phe-120, наступает полная инактивация.

О важности для активности фермента His-12 и его функционировании в активном центре фермента свидетельствуют результаты карбоксиметилнрования РНазы иодацетатом (ИА) при рН 5,5, т. е. в условиях, при которых преимущественно происходит карбоксиметилированне гистидина. Степень инактивации РНазы оказывается пропорциональной степени карбоксиметилнрования; полностью лишенный активности фермент содержит только одну карбокснметильную группу (на молекулу РНазы). При ионообменной хроматографии карбоксиметнлированной РНазы обнаруживают две химически различные формы фермента; одна из них (выход ~15%) названа l-Cm-His-119-РНазой (Ст=карбоксиметил), а другая (выход ~85%) 3-Cm-His-12-PHa3oii. Обе формы являются неактивными; при этом важно отметить, что ни одна нз форм не содержит двух модифицированных остатков гистидина. Различие структуры обеих форм схематически изображено ниже:

3-Cm-His-12-PHa3a l-Cm-His-119-РНаав

Анализ показал, что в 3-Cm-His-12-PHa3e His-12 карбоксиметн-лирован по атому азота в положении 3, а в 1-Cm-His-l 19-РНазе His-119 — по атому азота в положении 1.

nh2 nh2 ¦ - ? ch2-ch-cooh ?-j ch2-ch-cooh

n4J^n-ch2-cooh ноос-сн2-ы!^ы

^-карбоксиметилгистпиаин г43-карбоксиметилгисти9ин

9. ФЕРМЕНТЫ. II

309

Следует отметить, что при дальнейшем действии ИА на обе моно-карбоксиметилированные формы РНазы алкилирования незамещенного гистидина не происходит. Эти данные показывают, что остатки гистидина выступают как нуклеофилы, вытесняя реакцн-онноспособиый атом иода ИА, что приводит к образованию кар-бокснметилированных производных гистидина. Полученные данные позволяли также предполагать, что His-12 и His-119 сближены в активном центре, при этом His-119 способствует алкилнрованню His-12, a His-12 — алкилированию His-119.

ГЧ/?? His-119

I—сн,—с

о

\

о

+ h2n^n Hls-12

N^N—Cm

l-Cnbffi.s-119

О

His-119

o/ch-ch2-i + ^

His-12

Cm—N^^N 3-Cm-Hi.s-V2

Таким образом, алкилирование осуществляется благодаря надлежащей ориентации гистидинов, соответствующему расстоянию между ними, а также вследствие электростатического взаимодействия между заряженными имидазольными группами и карбокси-латной группой ИА. То обстоятельство, что His-119 алкилируется в большей степени, чем His-12, свидетельствует о более высоком значении рК имидазольной группы His-12 и о том, что при рН 5,5 он находится почти полностью в протонированной форме. В по-

S0% ВИ1ТШВНОС1Г1И

неактивная

неактивная

310

II. КАТАЛИЗ

Рис. 9.8. Строение рибонуклеазы S. Показано взаиморасположение His-12, His-119 и Lys-41 в активном центре, а также четыре дисульфидные связи. [Spande Т. Е.. Wlikop В., Degani J., Patchornik ?., Adv. Protein Chem., 24, 235, 1970.]

следующих исследованиях показано, что р/С для His-12 и His-119 равны 6,2 и 5,8 соответственно, при связывании же ингибитора они повышаются до 8,0 и 7,4.

При лиофилизации фермента из 50%-ной уксусной кислоты образуются димеры, обладающие полной активностью. При смешивании равных количеств неактивных 1-Cm-His-l 19-РНазы и 3-Cm-His-12-PHa3bi и лиофилизации из уксусной кислоты также образуются димеры. Более примечательным является то обстоятельство, что lU димеров алкилированных форм проявляет активность, соответствующую 50%-ной активности немоднфицирован-ных димеров. Активность таких димеров утрачивается при их диссоциации в результате нагревания при 67 °С в течение 10 мин. Объяснение этих данных приведено на схеме (с. 309). При растворении карбоксиметилированной РНазы в 50%-ной уксусной кислоте нековалентные связи между МН2-концевым участком (остатки с 1-го по 20-й) и остальной частью полипептидной цепи разрываются подобно тому, как это происходит при отделении S-пептида от S-белка при диссоциации в кислой среде. При лиофилизации S-пептидные области двух различных молекул эффективно взаимодействуют с соответствующими областями S-белков, образуя

9. ФЕРМЕНТЫ. II

311

димеры, как показано на схеме; из трех типов образующихся ди-меров два оказываются неактивными, поскольку в каждом из сформированных активных центров оказывается алкилирован-ным либо His-119, либо His-12; в то же время в димерах третьего типа формируются один продуктивный активный центр (не включающий остаток алкилированных гистидинов), а другой неактивный, содержащий 1-Crn-His-l 19 и 3-Cm-His-12.

Определены пространственные структуры РНазы и РНазы-S; оказалось, что они отличаются только в области, в которой в РНазе-S расщеплена пептидная связь. Как видно из рис. 9.8, молекула имеет форму почки с выраженным углублением на одной стороне, в котором локализуются His-12 и His-119 — остатки, которые на основании данных, полученных с помощью химической

Рис. 9.9. Модель связывания динуклеотидфосфата UpCH2A с РНазой-S (жирные линии — связи). His-119 показан в одном из четырех возможных положений, найденных при кристаллографическом исследовании. В нативном белке ?-?? +3 группа Lys-41 смещена вниз и проекцируется сзади фосфатной группы однако не контактирует с ней. Метиленовая группа —СН2— (между фосфором 'и рибозой) ингибитора влияет на положение His-119. \Richards F. ?., Wyckoff ?. W., p. 647, in: P. Boyer, ed., The Enzymes, vol. IV, Academic Press, Inc., New York, 1971.J

Рис. 9.10. Связывание субстрата, а — субстрат находится в активном центре,

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)