треннюю мембрану митохондрии благодаря простой диффузии. Липидный бислой и связанные с ним белки представляют собой эффективный барьер для большинства органических соединений и для ионов. Вход внутрь матрикса митохондрии или выход из него совершается либо посредством облегченного обмена на специфическом белке, который служит в качестве носителя (разд. 11.3.2), либо посредством активного транспорта (разд. 11.3.2). Пока еще нет достаточно подробного представления о том, каким образом группа переносчиков во внутренней мембране сообща поддерживает на соответствующих уровнях концентрации различных субстратов цикла лимонной кислоты в митохондри-альном матриксе. Но очевидно, что эти устройства эффективны и, например, не допускают избыточного внутримитохондриального накопления пирувата или цитрата, когда эти вещества не окисляются, или не препятствуют входу малата извне, если он требуется для поддержания работы цикла.

На рнс. 12.6 показаны основные механизмы регуляторного контроля цикла. В некоторых участках стимуляция или ингибирование определяется относительными концентрациями [NADH]/[NAD1-], [АТР]1/[ADP] или [AMP], [ацетил-СоА]/[СоА] или [сукци-нил-СоА]/[СоА]. Когда эти отношения высоки, клетка достаточно обеспечена энергией и поток через цикл замедлен; когда же они низки, клетка испытывает потребность в энергии, и поток через цикл ускоряется.

Как необратимая реакция, соединяющая метаболизм углеводов •с циклом лимонной кислоты, пируватдегидрогеназная реакция должна хорошо контролироваться. Это достигается двумя способами. Во-первых, фермент, который активируется несколькими интер-меднатами гликолиза, конкурентно ингибируется своими собственными продуктами — NADH и ацетил-СоА. При прочих равных условиях увеличение отношения [NADH]/[NAD+]' от 1 до 3 вызывает '90%-ное снижение скорости реакции, а увеличение отношения [ацетил-СоА]/[СоА] приводит к количественно подобному эффекту. Эффект проявляется мгновенно. Медленнее возникают, но дольше действуют эффекты другого регуляторного устройства. С сердцевиной каждой «молекулы» дигидролипоилтрансацетилазы связано около пяти молекул киназы пируватдегидрогеназы, которая за счет АТР катализирует фосфорилирование серинового остатка в •«-цепи пируватдегидрогеназного компонента. Будучи фосфорили-рован, фермент не способен декарбоксилировать пируват. Km для связывания тиаминпирофосфата возрастает в несколько раз, начиная от 50 нмоль/л, и добавленный оксиэтилтиаминпирофосфат не может отдать свой С2-фрагмент остатку липоевой кислоты. Киназа, как н сама дегидрогеназа, чувствительна и к [NADH]/[NAD+], и к "[ацетил-СоА]/'[СоА], но в этом случае NADH и ацетил-СоА выступают как стимуляторы киназы; то же относится и к АТР. Вместе

12. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. I

415

фру К тозоЭифосфагп

пируват

COz+ ацетил-СоА-

- оксалоацетат

цитрат

у? изоцитрат

СОо + ci-кетоглутпарат

NADH

___L

СОг + сукцинит-СоА

Синат I х-----

----г

ZL.J

фумврат

4 I

-оксало ацетат—

АТР —?—

— — ?

Рис. 12.6. Некоторые аспекты саморегуляции цикла лимонной кислоты; / — сти<-муляция; 2 — ингибирование.

с тем с трансацетилазой связано несколько молекул Ca2+-Mg2+-3a-висимой фосфатазы, действие которой восстанавливает активность пируватдегндрогеназы.

Когда происходит окисление жирных кислот, пируватдегидро-геназа заметно ингибируется. По-видимому, это явление объясняется сопутствующими процессу окисления высокими концентрациями АТР, ацетил-СоА и NADH. Большинство тканей содержит избыток пируватдегндрогеназы, так что после приема корма в печени, а также в мышце и в жировой ткани у животных в состоянии покоя лишь 40, 15 и 10% пируватдегндрогеназы соответственно на-

416

III. МЕТАБОЛИЗМ

ходится в активной, нефосфорилированной форме. Когда возрастает потребность в АТР, концентрации NAD+, СоА и ADP возрастают за счет использования NADH, ацетил-СоА и АТР, а киназа инактивируется. Однако фосфатаза продолжает функционировать, вновь активируя дегидрогеназу. Повышение [Са2+] может активировать митохондриальную фосфатазу, уменьшая даже в 20 раз эффективную Km по фосфорилированному ферменту, выступающему в качестве субстрата для фосфатазы.

Синтез цитрата — стадия, лимитирующая скорость цикла лимонной кислоты. До некоторой степени регуляция на этой стадии совершается благодаря небольшому, но достаточно значимому ин-гибнрованию цитрат-синтазы посредством NADH и сукцинил-СоА, -одновременное связывание которых с ферментом вызывает повышение Km ацетил-СоА. Но основное влияние на скорость синтеза цитрата оказывает поступление субстрата. Если запас АТР пополняется, то связанное с этим увеличение [NADH]'/[NAD+] автоматически вызывает повышение отношения [малат]/[оксалоацетат], сильно уменьшая подачу того субстрата, который в любом случае должен возвращаться из более ранних стадий цикла, так как цикл «протекает», только если NAD+ и ADP легко доступны.

Активность изоцитратдегидрогеназы регулируется в зависимости от концентраций Mg2+, изоцитрата, NAD+, NADH и AMP. Кроме субстратсвязывающих центров для NAD+, изоцитрата и Mg2+ •фермент имеет еще и положительные, и отрицательные эффектор-:ные участки. Изоцитрат — положительный эффектор; его связывание кооперативно, т. е. связывание на каком-либо одном участке облегчает связывание на других. Оба участка связывания для AMP стимулируют активность фермента. Когда они заполнены, связывание изоцитрата облегчается. В направлении уменьшения активности работают четыре участка, которые могут заполняться или NADH. или АТР, повышая таким образом Km для изоцитрата на субстратных центрах.

Таким образом, ферментативная активность определяется отношениями [NAD+]/[NADH] и [АМР]/[АТР].

AMP—-положительный эффектор комплекса а-кетоглутаратде-гидрогеназы, который в этом отношении напоминает изоцитратде-тидрогеназу. Связывание AMP уменьшает Km для а-кетоглутарата ¦в 10 раз. В области физиологических концентраций и сукци-нил-СоА, и NADH обладают ингибирующим действием, причем концентрация сукцинил-СоА, по-видимому, главный фактор, управляющий скоростью процесса. Сукцинатдегидрогеназа напоминает изоцитратдегидрогеназу в том отношении, что субстрат (сукцинат) выполняет функцию положительного аллостерического эффектора. ¦Оксалоацетат — мощный ингибитор, однако неясно, действует ли этот контроль в нормальных условиях.

[2. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. I

417

12.3. Структура митохондрии

Превращения глюкозы в результате завершения цикла лимонной кислоты можно представить следующим образом:

глюкоза + 10NAD+ + 2FAD -»- 6С02 -f 10NADH + 2FADHjj

[АТР, получающаяся при гликолизе (разд. 14.4.3) и при превращениях сукцинил-СоА, образующегося в цикле лимонной кислоты (разд. 12.2.2), в этом уравнении не принимается во внимание.] Реакции цикла лимонной кислоты катализируются ферментами, из которых все, кроме сукцинатдегидрогеназы, растворены в жидкости митохондриального матрикса. Напротив, реакции, при которых NADH и FADH2 окисляются и большая часть сопряженно выделяющейся свободной энергии сохраняется в результате синтеза АТР, катализируются ферментами, которые либо являются частью митохондриальной внутренней мембраны, либо прочно прикреплены к ней. Поэтому ниже в общих чертах рассмотрена эта структура.

Митохондрии, обнаруженные во всех клетках животных и растений, как правило, представляют собой тельца продолговатой формы размером 0,5X3 мкм. В живой клетке форма отдельных митохондрий может варьировать от нитей до палочек, петель и сфер. В некоторых тканях митохондрии выстраиваются в клетках таким образом, чтобы облегчить доставку АТР к использующим энергию структурам. Так, например, они располагаются в ряд вдоль сократительных волокон мышечных клеток, сосредоточиваются в соответствии с направлением движения секрета в ацинар-ных клетках поджелудочной железы или обволакивают своеобразной оболочкой (от середины до основания) структуры хвостов сперматозоидов. Число митохондрий варьирует в зависимости от размера и энергетических потребностей клетки. Так, в одной клетке спермы может содержаться 250, в клетке печени — от 500 до 2000, а в клетке гигантской амебы Chaos chaos — 500 000 митохондрий.

Серийные исследования тщательно выполненных срезов отдельных клеток показывают, что дрожжевые митохондрии имеют большую величину по сравнению с той, которую предполагали ранее. Выраженная неправильность и аморфность их формы приводят к тому, что очень тонкий срез одной митохондрии можно принять за несколько более мелких митохондрий. Во всяком случае, митохондрии— это те основные компоненты животных и растительных клеток, которые участвуют в окислительном метаболизме; ~20% всего белка клеток печени заключено в митохондриях.

Кроме ферментов цикла лимонной кислоты митохондрии содержат системы, переносящие электроны от интермедиатов цикла лимонной кислоты к кислороду; в них также реализуются меха-

27—1148

418

III. МЕТАБОЛИЗМ

низмы, благодаря которым энергия этого процесса сохраняется в результате образования АТР. Эти органеллы также содержат ферменты окисления жирных кислот (гл. 17), ферменты метаболизма фосфоглицеридов и других структурных липидов (гл. 18), различные ферменты метаболизма азота, такие, как глутаматдегидроге-наза и несколько аминотрансфераз, и некоторые ферменты, необходимые для синтеза мочевины (гл. 21). На самом деле, митохондрия сердца быка может содержать набор из 100 различных белков.

Все митохондрии состоят из двух отдельных мембранных мешков. Мембрана внутреннего мешка отдалена на 50—100 А от мембраны наружного, которая образует границу между клеточным соком и содержимым митохондрии. Наружная мембрана примерно на 50% состоит из липида и на 50% —из белка. Внутренняя мембрана— это более плотная структура, около 3/4 массы которой составляет белок, а 1/4 — смешанные липиды. Внутренняя мембрана, как правило, располагается параллельно наружной, по всей окружности частицы, но характеризуется присутствием больших направленных внутрь складок (инвагинаций), называемых кристами (рис. 12.7). В митохондриях печени кристы составляют единое целое с внутренней мембраной; э