Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

и коферментом. Связывание восстановленного никотинамиднуклеотида с определенным флавопротеидом приводит к гашению флуоресценции рибофлавином посредством механизма, аналогичного действующему в растворах динуклеотида.

Кинетические данные, изучение комплексов с переносом заряда, исследования поляризации флуоресценции и использование аналогов как субстратов, так и коферментов подтверждают вывод о том, что центральный момент в действии этих дегидрогеназ — образование тройных комплексов, включающих фермент, субстрат и кофермент. В случае лактатдегидрогеназы, например, последовательные этапы процесса, очевидно, происходят благодаря следующему обязательному порядку связывания компонентов реакции:

NADH пируват лактат NAD*

1 1_I-1—

?-> ? -NADH -> ? -NADH- пируват-> ? -NAD+-лактат-> ? -NAD* ¦-» ?

Таким образом, пируват не может связываться с лактатдегидро-геназой до тех пор, пока не образован комплекс фермента с NADH, что свидетельствует об отсутствии пируватсвязывающего центра на поверхности фермента. Этот центр, вероятно, возникает в результате изменений конформации и/или заряда и т. д. вслед за образованием комплекса фермента с NADH. Сходными характеристиками обладают каталитические циклы многих дегидрогеназ, например алкогольдегидрогеназы печени. Иногда, например в случае глутаматдегидрогеназы, не существует обязательного порядка связывания; ни разу не удалось обнаружить, чтобы в обязательном порядке первым связывался субстрат, а не кофермент.

Характер связывающих центров для кофермента и субстрата на ферменте придает специфичность реакции. Эти связывающие центры находятся на специфических участках олигомерной формы фермента. Так, бычья глутаматдегидрогеназа (мол. масса 336 000) может диссоциировать на субъединицы (мол. масса 56 000), которые больше не обладают ферментативной активностью; однако агрегатам с мол. массой ^336 000 уже свойственна активность. Сходным образом глицеральдегидфосфатдегидрогеназа мышцы (мол. масса 140 000) может диссоциировать на ферментативно инертные субъединицы. Связывание специфического кофермента, по-видимому, способствует как поддержанию конформации, так и сохранению специфической субъединичной структуры некоторых дегидрогеназ.

30—1148

466

III. МЕТАБОЛИЗМ

NH2C^

COOH

Рис. 13.3. Схематическое изображение NAD-связывагащего участка в дсгндрогена-зах, рассматриваемых сверху, перпендикулярно многотяжевому складчатому слою. а — вид сверху; б — вид поперечного среза. [Rossman ?. G., Liljas ?., Bran-den C.-I., Banaszak L. J., p. '68, in: P. D. Boyer, ed., The Enzymes, vol. XI, 3d ed.. Academic Press, Inc., New York, 1975.]

Молекулярные массы никотинамиднуклеотидзависимых дегидрогеназ варьируют в широком диапазоне. Большинство из них обнаруживает каталитическую активность только тогда, когда субъединицы объединены в димерной, тетрамерной или гексамерной форме, как, например, субъединицы малат-, лактат- и глутамат-дегидрогеназ. В большинстве случаев идентичные субъедшшцы самопроизвольно собираются в устойчивый, каталитически активный полимер. Иногда клетка образует более одного вида субъедиииц, отличающихся разным числом аминокислотных замещений

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

467

в полипептидной цепи, которая у них в общем подобна. В этих условиях происходит гибридизация, приводящая к образованию изоферментов с различной субъединичной структурой. Первым хорошо изученным примером такого рода была лактатдегидрогеназа. Ткани млекопитающих продуцируют две электрофоретически различимые субъединицы ? и ?, так что образуются пять отчетливых изоферментов лактатдегидрогеназы: си, ?3??, ?2?2, ???3 и ?4. Они существенно различны по значениям Km и Vmax. Гибридизация может быть также достигнута in vitro с субъединицами из весьма отдаленных видов, например с лактатдегидрогеназами дрожжей и мышцы кролика. Присутствие NAD+ во время смешения заметно ингибирует гибридизацию, в то время как NADH ускоряет ее.

Рис. 13.4. Схематическое изображение связывания пирувата и NAD+ с лактатдс-гидрогеиазой. [Holbrook J. J., Liljas ?., Steindel S. J., Rossmann M. G., p. 240, in: P. D. Boyer, ed., The Enzymes, vol. XI, Academic Press, Inc., New York, 1975.]

30*

68

III. МЕТАБОЛИЗМ

ч

о

Рис. 13.5. Механизм действия лактатдегидрогеназы. [Holbrook J. J., Lit-jas ?.. Steindal S. J., Rossmann M. G., p. 243, in: P. D. Boyer, ed., The Enzymes, vol. XI, Academic Press, Inc.,

New York, 1975.]

H2N.

V

/

NH

Arg-108

? HN

+

? NH

Y

Arg-m

NH

Очевидно, что в присутствии NAD+ связь между тетрамерами упрочняется, в то время как NADH способствует ослаблению прочности структуры.

В печени присутствуют две различные субъединицы алкоголь-дегидрогеназы (Е и S), дающие начало формам Е2, ES и S2. Полученная из печени лошади форма Е2 имеет высокую активность по отношению к алифатическим спиртам с низкой молекулярной массой, тогда как форма S2 эффективна в реакциях восстановления 3-кетостероидов и ретиналя до соответствующих З^-оксисте-роидов и ретинола; ES обладает промежуточными свойствами. Такая же картина наблюдается в случае фермента из печени человека, но в этом случае Е2 обладает небольшой стероид-дегнд-рогеназной активностью, a S2 сохраняет активность с алифатическими спиртами.

Выяснена аминокислотная последовательность для нескольких дегидрогеназ и с помощью рентгеноструктурного анализа установлена трехмерная структура алкогольдегидрогеназы из печени лошади, глицеральдегидфосфатдегидрогеназы омара, цитоплазматп-ческой малатдегидрогеназы из сердца свиньи и лактатдегидрогеназы из акулы. Как показано на рис. 13.3, полипептидная цепь каждой из этих субъединиц в их нормальных полимерных формах образует структуру по типу складчатого слоя из шести нитей, где связывается аденилатная часть молекулы кофермента. На поверхности имеется щель, в которой многочисленные гидрофобные, электростатические взаимодействия и водородные связи удерживают на своих местах и кофермент, и субстрат.

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

469

На рис. 13.4 изображено связывание NAD+ и пирувата в каталитическом центре субъединицы мышечной лактатдегидрогена-зы. Каталитический центр не только обеспечивает сближение этих двух субстратов, но благодаря наличию специфических R-rpynn в аминокислотах облегчает реакцию (рис. 13.5).

Алкогольдегидрогеназа представляет собой особый фермент в том смысле, что каждая субъединица содержит два Zn2+, один из которых физически стабилизирует третичную структуру фермента благодаря связям с лигандами — сульфгидрильными группами остатков цистеина в положениях 97, 100, 103 и 111,— а другой, участвующий в каталитическом цикле, связан с сульфгидрильными группами цнстеиновых остатков в положениях 46 и 174 и с имидазольной группой гистидина-67; четвертое координационное положение этого атома заполнено молекулой воды или гидроксидным ионом. Присоединение NAD+ к ферменту вызывает выброс протона в соответствии с механизмом, схема которого приведена на рис. 13.6. Цикл каталитической реакции показан на рис. 13.7.

По крайней мере в одной реакции — в окислении ЬЮРглюкозы до иОРглюкуроновой кислоты — две молекулы NAD+ последовательно используются для отнятия четырех электронов от субстрата без диссоциации промежуточного полуокисленного продукта. Реакция требует участия как аминогруппы, так и сульфгидрильной (тиоловой) группы фермента (рис. 13.8). Промежуточными продуктами являются шиффово основание альдегидного интермедиа-

активный центр 1 ?

вода ?—О 1 ? н-о(-' к ¦

Ser-46 R-0 -? -- R-? ?

His-51 II NC А ?. t> N +

ЦК 9,6 pK 7,6

NAD+

Рис. 13.6. Система водородных связей, образуемых связанной с Zn2+ молекулой воды, серином-48 и гистндином-51 алкогольдегидрогеназы печени; показан механизм освобождения протонов, вызываемого присоединением NAD+. \Branden C.-I., Iornva.ll ?., Eklund ?., Furugren В., p. 162, in: P. D. Boyer, ed.. The Enzymes, vol. XI, 3d ed., Academic Press. Inc., New York, 1975.]

470

III МЕТАБОЛИЗМ

NADH (7) E_Zn2*-HOH NADH-E —Zn2+-HOH

? - Zn2+-HOH -NADH

? I

? — Zn2+—0=C-R I-NADH

NAD*

NAD+-E— Zn2+-HOh

? — ??2+-???

I-NAD+ H

-HO-C-R ?

??+???-

E — Zn2+—O-C-R NAD* H

Рис. 13.7. Каталитический цикл алкогольдегидрогеназы печени (? — фермент).

H2N:^c-HNAD® ?—О

UDP'

t-ь-н

? /

????

J—о

??+.?2? + ????^ ^LUD|,

\

COOH

?- S

E-SH им- I ? n2™- r-ct

:??2 L_n

?,?^' ? +NAD© НфС-Н

U DP

+

E-SH

?,?

CV"udp wudp~ 0-uDp ^

+ NADH + H+

Рис. 13.8. Механизм действия иОРглюкозодегидрогеназы (? — фермент). Обратите внимание, что образование шиффова основания и тиоэфира — неотъемлемые стадии окислительного процесса. [Ordman А. В., Kirkwood S.. J. Biol. Chem., 252,

1324, 1977.]

13. биологическое окисление. II

471

та и тиоэфир кислоты, образующейся в результате суммарного процесса. Отметим, что оба этих промежуточных соединения образуются в окислительных реакциях.

13.1.1. Никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназа

Некоторые бактерии, особенно Pseudomonas aeruginosa, содержат флавопротеид, катализирующий обратимый перенос водорода из положения 4-В NADPH в положение 4-В NAD+ с образованием NADH. Активный фермент представляет полимер, составленный нз одной субъединицы (мол. масса 50 000), с которой связана одна молекула FAD. Кинетические свойства фермента отличаются сложностью, и механизм реакции неясен. Энергозависимая трансгидрогеназа внутренней мембраны митохондрий (разд. 12.5), которая катализирует перенос водорода из положения 4-А NADH в положении 4-В NADP+, исследовалась недостаточно очищенной, поэтому выяснить механизм ее действия не удалось.

13.1.2. Другие функции NAD+

NAD+ участвует в нескольких необычных реакциях, в которых не используются окислительно-восстановительные свойства этого кофермента. ДНК-лигаза из Е. coli, катализирующая образование фосфодиэфирной связи между сшиваемыми 5'-фосфатным концом и З'-гидроксидным концом двух полидезоксирибонуклеотидов, осуществляет эту реакцию дегидратации с участием комплекса аде-нилил-фермент; этот комплекс образуется наряду с ник

страница 92
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.09.2019)