13.13. Спектр ЭПР флавожелезосеропротеида из митохрондрий сердца быка. а — окисленная форма: б — восстановленная форма, обнаруживающая сигнал свободного радикала от флавосемихинона при g=2 и восстановленного железо-сероцентра при g=l,94. [Beinert ?., Iron-Sulfur Centers of the Mitochondrial Electron Transfer System, p. 83, in: W. Lovenberg. ed., The Iron-Sulfur Proteins, vol. Ill, Academic Press, Inc., New York, 1977.]

(рис. 13.13). Такое поведение может показаться парадоксальным. Спектры ЭПР в норме наблюдаются для Fe3+, а не для Fe2+, и притом при значениях g, превышающих значения g для свободного электрона (т. е. > 2,0023). В окисленных ферредоксинах высокоспиновые Fe3+-ueHTpbi антиферромагннтно сопряжены, т. е. их спины нейтрализуются через мостиковые серные лиганды. При восстановлении неспаренный электрон одного Fe34- нескомпенсиро-ван, но сильно делокализован, т. е. он относится скорее ко всему центру (Fe2S2) или (Fe4S4), чем к одному атому железа; таким образом объясняется низкое среднее значение g, равное ~1,94. Ферредоксины с двумя центрами, содержащими 4 атома железа, ведут себя сходным образом, когда восстанавливается только один центр, но при восстановлении обоих центров они участвуют в спин-спиновом сопряжении, подобно паре стержневых магнитов, и парамагнетизм отдельных центров нельзя обнаружить. Поведение ВПЖП противоположно поведению ферредоксинов; будучи окисленными, они парамагнитны и становятся диамагнитными при восстановлении, обнаруживая только слабый сигнал окисленных ферредоксинов при g = 2,01.

Гидрогеназы, очевидно, составляют особый класс железосеро-протеидов. Ферменты, полученные из С. pasteurianum, Desulfovib-

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

483

rio и Chromatium, содержат три, два и один (Fe4S4)-центр на молекулу соответственно. Все они катализируют обмен орто- и пара-водородов, а также выделяют Н2 при восстановлении ферредокси-ном. Детальный механизм действия этих белков остается невыясненным.

Предполагается, что сульфид, необходимый для образования железосероцентра, продуцируется реакцией с встречающимся повсеместно и содержащим железо ферментом роданезой, которая, как давно известно, катализирует реакцию между тиосульфатом и цианидом

SSO^- + CN- -> SO§- + SCN-

Печеночные митохондрии содержат роданезу, связанную с белком, богатым железосероцентрами. Ниже дана предварительная схема,

Таблица 13.4 Некоторые типичные же езосеропротеиды

Центр Молекулярная масса Еа. мВ Источник

Fe-рубредоксин 6 000 —60 Клостридии (облигатные анаэробы)

(РегБг) -ферредоксины 10 600 —120 Хлоропласты шпината

10 300 —400 Microcystic (сине-зеленые водоросли)

21 600 —З.т0 Azotobacter (аэробный, ?2-?11?-сирующнн)

12 600 —360 Е. coli (кишечная бактерия)

12 500 —240 P. putida (аэробная бактерия)

12 500 —270 Кора надпочечников

(Fe4S4) -ферредоксины 6 000 —330 Desulfovibrio (анаэробный, восстанавливающий S04)

8 800 —380 Bacillus (почва, ^-фиксирующий)

(Fe4S4) 2-ферредокси- 6 000 —395 Клостридии (облигатные ана-

ны эробы)

10 000 —490 Chromatium (пурпурная серобактерия, фотосинтезирующая)

15 000 . —420 Azotobacter (аэробный, Кг-фик-сирующий)

(Ре252)-ВПЖП 30 000 +280 Комплекс III нз митохондрий :ердца

(Fe4S4)-Bn/Kn 9 650 +350 Chromatium (пурпурная серобактерия, фотосинтезирующая).

31*

484

III. МЕТАБОЛИЗМ

в которой ?? — функциональный центр роданезы, а Е2—Fe— свободная от сульфида форма железосероцентра

FeS

Если железосероцентр не образуется, цианид атакует комплекс роданеза — сульфид с образованием тиоцианата. Физиологическая роль этого фермента неясна. Способность обезвреживать цианид, по-видимому, лишь его вторичное физиологическое достоинство. В табл. 13.4 перечислены типичные железосеропротеиды.

13.2.2. Флавопротеиды и железосероцентры

Некоторые флавопротеиды катализируют перенос электронов между никотинамиддинуклеотидами и белками, в которых железосероцентры служат в качестве единственных простетических групп. Два из них заслуживают упоминания. Хлоропласты содержат NADP-редуктазу, переносящую электроны от фотосинтетиче-ски восстановленного ферредоксина к NADP+, а в митохондрии коры надпочечников имеется подобный белок, в физиологических условиях использующий NADPH для восстановления адренодокси-на (разд. 13.6.6). Восстановленная форма последнего участвует в системе гидроксилирования стероидов в надпочечниках (гл. 45).

В некоторых случаях восстановления флавином железосероцентра последний входит в качестве интегрального компонента в структуру самого флавопротеида. К простейшим из таких устройств относится дигидрооротатдегидрогеназа из Zymobacterium oroticum (гл. 25). В одной молекуле (мол. масса 120 000) этого фермента содержится два FAD, два FMN и два (FeS) 2- Он катализирует реакцию

оротат -f NADH -f- Н+ ч * дигидрооротат + NAD+

Добавка NADH к ферменту приводит к быстрому образованию синего семихинона и к восстановлению (FeS)2-ueHTpoB. Путь электрона изобразится схемой

NADH —FAD —*-*¦ (FeSJu —FMN —^-v оротат

Кроме того, этот фермент — типичный представитель большой группы флавиновых дегидрогеназ, которые образуют устойчивые Семихиноны, участвующие в расточительном одноэлектронном восстановлении 02 до аниона супероксида 02· (свободный ради-

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

465

сукцинагл холин саркозин

I I 1

FMN

FeS FeS

-260 +30

NADH-

FMN ¦

FeSla,„ FeS3

-380 -240

-260

FeS, FeS2

-400 -20

Аушт-СоА

FAD

Cyt b~

-FeS-+280

¦Cyt с

\

o?- гл ицерофоефагп

Рис. 13.14. Железосеропротеиды в электронпереносящей цепи (E'Q — в милливольтах; UQ — убихинон).

кал). В действительности скорость образования синего семихинона у большинства флавопротеидов этой группы варьирует в широких пределах.

Дигидрооротатдегидрогеназа из митохондрий млекопитающих, участвующая в синтезе пиримидина (гл. 24), обладает совершенно иными свойствами. Фермент с мол. массой 61 000, по-видимому, содержит девять Fe2+ и два Zn2+, но не имеет в своем составе ни флавина, ни железосероцеитра. In vitro эта дегидрогеназа также посстанавливает 02 до супероксида, но в митохондриях она госстанавлнвает цитохром Ь.

13,2.2.1. Флавопротеиды и железосероцентры митохондрий

До последнего времени митохондриальная электронперенося-щая цепь представлялась в виде устройства, где флавопротеиды принимают входящие в цепь электроны субстратов, а остальная часть цепи организована в форме ряда цитохромов (разд. 13.3), свойства и поведение которых можно наблюдать посредством оптической спектрометрии. Применение метода ЭПР позволило обнаружить, что на самом деле цепь содержит большое число железосероцентров, превышающее число цитохромов, так что, по-видимому, она выглядит, как это представлено на рис. 13.14. До сих пор лишь несколько этих центров удалось отделить от других компонентов соответствующих комплексов.

Электроны от NADH и сукцината, генерируемых в цикле лимонной кислоты, а также электроны от СоА-производных жирных кислот (см. разд. 17.5.1) и других субстратов окисления, в том числе ?-глицерофосфата, холина и саркозина, входят в электронпере-носящую цепь через общий для всех акцептор — убихинон, кото-

32—1148

4S6

III. МЕТАБОЛИЗМ

рый при этом восстанавливается. В каждом случае фермент, окисляющий соответствующий субстрат, представляет собой флавопротеид, который содержит железосероцентр в качестве интегрального компонента дегидрогеназного белка. Будучи восстановленными, эти центры дают спектры ЭПР, сходные с теми, которые приведены на рис. 13.13. Только окисление NADH убихиноном происходит с участием механизма аккумуляции энергии для синтеза АТР; во всех остальных электронпереносящих системах, включающих флавопротеид и убихинон, Е'о субстрата, как такового, слишком близка к ?о убихинона, что делает невозможным образование АТР.

Комплекс I (разд. 12.4.1) осуществляет восстановление убихинона до семихинона за счет NADH. При расщеплении комплекса I удается выявить по крайней мере 10 отдельных полнпептидных цепей. Гидрофобная природа NADH-дегидрогеназы затрудняет получение нативного фермента в чистой форме. В лучшем препарате (мол. масса 70000) на одну молекулу фермента приходится один FMN, который легко удаляется при низком рН, и один (Fe4S4)-центр. Свойства этого препарата, как и следовало ожидать, не идентичны со свойствами дегидрогеназы, находящейся в фосфоли-пидной среде комплекса I; так, например, K^ADH в растворе в 15 раз больше К^АОН в комплексе I (7 мкмоль/л). Существенное различие состоит также в том, что нативный комплекс NADH-дегидрогеназы содержит 16Fe и 16S-2 на одну молекулу FMN. Исследования спектров ЭПР помогли обнаружить четыре отчетливых центра, сигналы которых проявляются по мере увеличения количества, добавляемого NADH. Расположение этих центров, по-видимому, соответствует изображенному на рис. 13.14. Ингибиторы, препятствующие восстановлению убихинона электронами от NADH, например амитал, ротенон или пирнцидин, вероятно, действуют между центрами 1 и 4 и центрами 2 и 3.

Препятствия подобного рода затрудняют понимание функций сукцинатдегидрогеназы, для которой Vmax в митохондриальной мембране вдвое выше, чем в растворе. Лучшие препараты состоят из белка (мол. масса ~ 70 000), который содержит ковалентно связанный FAD и два (Fe2S2)-центра; этот белок тесно связан с другим белком (мол. масса ~27 000), также имеющим (Fe4S4)-центр, но не содержащим флавииа. Приведенные сведения о структуре комплекса II согласуются с данными ЭПР о наличии трех отдельных железосероцентров в этом комплексе. Сукцинатдегидро-геназа легко ингибируется оксалоацетатом и малонатом, для которых значения Ki составляют 1,5 и 20 мкмоль/л соответственно, тогда как К^1(цинат = 300 мкмоль/л.

Молекулярные свойства других флавожелезосеропротеидов митохондрий сравнительно мало известны. Субстратом ЭПФ-дегид-

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

4Ь7

рогеназы является флавопротеид (ЭПФ); этот флавопротеид восстанавливается при вза