Биологический каталог




Основы биохимии. Том 2

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

ентарных концов, после чего между ними вамы-кают ковалентные связи с помощью ДНК-лигазы. Очевидным тре-

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕ1АБОЛМЗМА. I

1035

бованием к этому методу является то, чтобы включение фрагмента не вызывало инактивации необходимых свойств вектора, т. е. способности к автономной репликации и проявлению селектирующего 'фенотипа, например устойчивости к тетрациклину.

Метод клонирования был успешно применен к ДНК ?'. laevis, обогащенной генами, кодирующими 18S и 28S рибосомальные РНК, чтобы получить клонированные фрагменты тех тандемных участков, где расположены эти гены (разд. 25.3.6.1).

Как правило, селекция специфических генов, .включенных в ДНК, удается лучше всего в том случае, если ген проявляется в клегке-хозяине Е. coli. Действительно, гибридные молекулы ДНК, содержащие гены ферментов синтеза триптофана у Е. coli (гл. 26), были выделены путем селекции в клетках, которые после включения гибридной ДНК в триптофановый ауксотроф уже не нуждались больше в триптофане для роста. Ген из дрожжей, который ко'птует один из ферментов (биосинтеза гистидина, имида-золглицерофосфат-дегидратазу (гл. 23), был клонирован и выделен аналогичным образом. Этот последний случай свидетельствует о том, что по крайней мере некоторые последовательности эука-риотной ДНК. могут быть транскрибированы и транслированы в Е. coli с достаточной точностью для проявления генетического выражения и, следовательно, метод может найти широкое применение при клонировании и проявлении генов млекопитающих в простейших бактериальных клетках.

25.4.2. Синтез генов in vitro

Разработка химических методов синтеза коротких (от 8 до 15 остатков) олигонуклеотидов позволила провести полный синтез гена, кодирующего одну из тирозинепецифичных тРНК Е. coli (гл. 26). Этот метод, более подробно описанный в следующей главе, применим для синтеза любого гена, последовательность которого известна, и предоставляет другой подход для манипуляции с определенными генетическими элементами.

25.5. Нуклеотидный код и структура белков

Так как ДНК представляет собой линейную комбинацию нуклеотидов, связанных фосфодиэфириой связью, то закодированная в ДНК генетическая информация должна специфически передаваться последовательностью оснований (еахарофосфатный скелет одинаков по всей цепи). Ранее были представлены данные о том, что за синтез ферментов ответственны определенные гены. Аналогичные данные указывают на то, что гены направляют синтез всех белков вне зависимости от их физиологической функции. Нуклеи-

32—1358

а 034

III. МЕТАБОЛИЗМ

гновые кислоты растительных вирусов и бактериофагов .проникают гв клетку без белка оболочки. Тем не менее вновь образованные -вирусные частицы .содержат полный комплект белков, а в клетке--хозяине образуются также все вирусспецифические ферменты

(гл. 28). Таким образом, вся информация для синтеза специфиче-'скнх белков содержится в нуклеиновой кислоте.

Некоторые люди имеют гемоглобин HbS, который при дезокси-ггенации гораздо менее растворим, чем нормальный гемоглобин

(гл. 31). Эритроциты, содержащие HbS, претерпевают изменение •формы, становятся серповидными, что объясняется агрегацией де--зокоигемоглобина. Способность организма образовывать HbS передается по наследству. HbS отличается от НЬА (нормального темоглобина) одним аминокислотным остатком в ?-щепи (гл. 26). .Для другого аномального белка также было показано, что он •отличается от нормального единственной аминокислотной заменой :(гл. 26). Более того, видовые различия многих гомологических бел-жов (гл. 27) заключаются в замещении аминокислотных остатков -в определенных положениях пептидной .цепи. Таким образом, ген, "кодирующий синтез ?-цепи, должен определять аминокислотную последовательность белка; мутация, т. е. изменение ДНК, приводит к изменению последовательности (В белке.

Гемоглобин человека состоит из а- и ?-цепей (рис. 4.2), синтез которых обусловлен генами, локализованными .в различных хромосомах. Таким образом, гипотеза ¦—«один ген — один фермент» должна быть переформулирована «один ген —одна полипептидная цепь», так как индивидуальные ферменты и другие белки содержат обычно, одну или несколько цепей. Генетическая определенность структуры белка связана с последовательным расположением аминокислот в цепи или ,в цепях. В связи с этим концепцию о последовательности можно теперь сформулировать следующим образом: последовательность аминокислот в белке определяется последовательностью нуклеотидов в соответствующем участке ДНК. Сейчас мы рассмотрим некоторые следствия этой гипотезы.

25.5.1. Специфическая конформация белков

Глобулярные белки проявляют свои характерные свойства только в нативном состоянии; в связи с этим можно задать вопрос, контролируется ли генетически сложная специфическая укладка полипептидной цепи? Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что аминокислотная последовательность как таковая определяет укладку полипептидной цепи с образованием нативной конформации. Это подтверждается тем, что многие высокоочищен-ные белки могут быть денатурированы, т. е. переведены в беспорядочное состояние, но ib подходящих экспериментальных условиях они спонтанно восстанавливают свои нативные свойства (гл. 6).

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. 1

1035-

Примером служит обратимая денатурация гемоглобина, описанная ранее (разд. 6.6). В молекуле гемоглобина нет дисульфидных связей, и пространственная укладка ее обусловлена только некова-лентными силами, т. е. -гидрофобными силами, водородными связями и ионными взаимодействиями (разд. 6.3 и далее). Подобным, образом и молекулы других белков не имеют дисульфидных связей — это миоглобин, энолазы, различные амилазы и цитохром с, В каждом случае возврат из беспорядочного состояния к нативно-му требует перестройки сотен специфических связей на молекулу.

Наиболее убедительной иллюстрацией до настоящего времени является поведение рибонуклеазы, которая содержит четыре внутри цеп очечные дисульфидные связи (разд. 9.3.2). При восстановлении этих связей образуются восемь сульфгидрильных групп и беспорядочно свернутая полипептидная щепь. Реокислеиие в мягких условиях переводит фермент в нативное состояние, т. е. реализуется одна из 256 возможных комбинаций восстановления дисульфидных связей. В этом случае определенная специфическая аминокислотная последовательность обусловливает определенное пространственное расположение соответствующих пар сульфгидрильных трупп перед окислением, и при этом сложенная полипептидная цепь находится в наиболее термодинамически стабильном состоянии. Таким образом, генетическое влияние на конформацию-выражается в определении положения тех остатков, которые критичны для образования соответствующей конформации и, следовательно, для функциональных свойств белка.

Молекулы многих белков состоят из двух и более щепей.. У некоторых из них цепи объединены за счет нековалентных сил, например в гемоглобине'(гл. 31), альдолазе (гл. 14), тлутаматде-гидрогена!зе (тл. 6) и т. д. В этих случаях диссоциация и ассоциация легко обратимы при воздействии тех же факторов окружающей среды, которые контролируют конформацию отдельных полипептидных цепей. Таким образом, для образования многоцепочечных белков нет специальных генетических факторов; их образование является следствием генетической .информации, выраженной в аминокислотной последовательности лолипептидных цепей, входящих в состав \белка.

У некоторых многоцепочечных белков, таких, как инсулин, химотрипсин и ллазмин, цепи свяваны дисульфидными мостиками. Однако в этих и других случаях неактивный белок-предшественник синтезируется в виде единой цепи; затем образуются дисульфидные связи, как это было описано выше для РНазы. Образование многоцепочечных активных форм является результатом протеолитического расщепления с утратой фрагмента исходной полипептидной цепи, а оставшиеся пептидные цепи оказываются скрепленными дисульфидными связями. Это было описано раньше для химотрипсина (рис. 8.14), но справедливо также и для превраще-

32*

3036

iii. МЕТАБОЛИЗМ

яшя плазМ'Иногена ib плазмин (гл. 29) и проинсулина в инсулин (гл. 46).

Так как укладка и самооборка сложных глобулярных белков -идут благодаря генетически детерминированной аминокислотной последовательности, то очевидно, что это применимо и ?? более ¦сложным агрегатам, таким, как некоторые ферменты пируватдегидрогеназного комплекса (разд. 12.2.1) и другие мультифер-ментные комплексы. В самом деле, так как основная роль генов заключается в кодировании полипептидных депей, то оборка должна быть преимущественно самосборкой, т. е. без дальнейшего вмешательства генетических детерминант. Для некоторых вирусов, например бактериофага Т4 (гл. 28) и рибосом (гл. 26), было показано, что эти сложные структуры могут быть разобраны на -индивидуальные компоненты и затем возможно спонтанное восстановление нативной структуры, если добавлять компоненты в определенном порядке. Тот факт, что многие органеллы и мембранные структуры содержат также липиды, полисахариды « т. д. и для правильной сборки необходимо присутствие и этих соединений, не -противоречит этой точке зрения, так как эти компоненты клетки также образуются при каталитическом действии ферментов, структура которых генетически детерминирована.

25.5.2. Простетические группы и модификация аминокислот

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что не существует прямого генетического контроля за процессами, с помощью которых неаминокислотные простетические группы вводятся в белки. Спонтанная рекомбинация гема с глобином- при образовании гемоглобина (разд. 6.6) указывает на то, что нет необходимости предполагать какой-либо специальный генетический контроль.

Аналогичным образом многие ферменты, содержащие способную диссоциировать простетическую группу или кофактор, например флавины, гем, пиридоксальфосфат, NAD, NADP или ионы металлов, регенерируются спонтанно при добавлении простетиче-ской группы к апоферменту (белку) в подходящих условиях. Можно привести еще более удивительный пример. Беспорфириновый мутант Е. coli не обладае

страница 100
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 2" (8.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)