|
|
Основы биохимии. Том 2сов, ингибиторы отдельных специфических реакций сыграли большую роль при выделении стадий биосинтеза нуклеиновых кислот и белков. Некоторые из этих ингибиторов являются синтетическими соединениями, другие были впервые выделены из культу-ральных фильтратов различных организмов как антибиотики и использовались при попытках лечить инфекционные заболевания или ингибировать рост малигнизированных тканей. Соединения, которые ингибируют образование пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, косвенно блокируют образование нуклеиновых кислот; они описаны в гл. 24. Ингибиторы синтеза мРНК, которые блокируют ДНК-зависимую РНК-полимеразу, будут рассмотрены ниже. В этом 26. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. II 1053 разделе мы рассмотрим ингибиторы, которые являются антибиотиками и влияют на трансляцию мРНК. Обладая способностью специфически реагировать с рибосомими прокариот, некоторые из этих агентов получили широкое распространение при лечении инфекционных заболеваний. Пуромицин, который структурно аналогичен аминоацил-тРНК, ингибирует синтез белка, маскируясь под аминоациладенозиновую часть аминоацил-тРНК и конкурируя с аминоацил-тРНК в качестве акцептора при реакции траиспептидации. После того как растущий пептид или формилметионин переносятся на аминогруппу пу-ромицина, вновь образованный пептидил- или формилметионилпу-ромицин покидает рибосому; это прерывает нормальный рост цепи, и неполная пептидная цепь, имеющая пуромициновый остаток на карбоксильном конце, уходит с рибосомы. СНзч /СН3 ?? ОН _ О ОН 0=С-СН-СН2—/ \—ОСН3 0=C-CH2R NH2 . NH2 пуромицин аминоацил-тРНК Стрептомицин ингибирует синтез белка, связываясь с ЗОБ-субъ-единицей; стрептомицин-ЗОБ-комплекс образует менее эффективный и более лабильный инициаторный комплекс, диссоциация которого прерывает процесс трансляции. Связывание стрептомицина с ЗОБ-субъединицей также меняет эффективность и точность связывания аминоацил-тРНК с соответствующим кодоном в А-участке. Устойчивость к стрептомицину и, более того, зависимость от него возникают в результате мутационных изменений отдельных белков рибосомальной ЗОБ-субъединицы. Тетрациклин ингибирует элонгацию полипептидных цепей, блокируя вхождение аминоацил-тРНК в ?-участок; растущая полипептидная цепь остается в Р-участке и может нормально реагировать с пуромицином. Хлорамфеникол блокирует пептидилтрансферазную активность 50S-субъединицы в 70Б-рибосомах. 1054 III. МЕТАБОЛИЗМ Циклогексимид, как предполагают, действует таким же образом, как и хлорамфеникол, на бОБ-еубъединицу в вОБ-рибосомах. Эритромицин связывается с 50Б-рибосомной субъединицей и, вероятно, блокирует стадию транслокации, «замораживая» таким образом пептидил-тРНК в ?-участке. Мутации, приводящие к устойчивости к эритромицину, затрагивают один из белков 50S-субъединицы рибосом Е. coli. Фусидовая кислота — стероид, который влияет на стадию транслокации после образования пептидной связи, вероятно, предотвращая расщепление GTP в сопряженной реакции расщепления GTP и транслокации с участием фактора EF-2. Дифтерийный токсин специфически ингибирует синтез белков у эукариот, но не у прокариот. После того как интактный токсин попадает в клетку, он претерпевает расщепление трипсиноподобньгм ферментом, в результате чего образуется фрагмент, который блокирует транслокацию, оставляя растущую пептидильную цепь в ?-участке. Активным фрагментом токсина является фермент, который катализирует перенос ADP-рибозной части NAD+ на белок EF-2, таким образом блокируя его активность. Реакция ADP-рибо-зилирования обратима, и ADP-рибоза может быть удалена с EF-2 добавлением большой концентрации никотинамида. дифтерийный NAD+ + EF-2 ( *" аденозиндифо:форибозил-ЕР-2 -j- никотинамид токсин 26.4. Генетический код В связи с тем что в ДНК имеются только четыре типа оснований, а белки содержат 20 аминокислот, очевидно, что для кодирования аминокислоты необходимо более одного основания. Пара или дублет оснований может кодировать только 16 аминокислот (42); в связи с этим было предсказано, что кодон, т. е. нуклео-тндная последовательность, кодирующая аминокислоту, должен быть триплетным. Самая первая экспериментальная проверка этой идеи заключалась в проверке последствий действия красителя профлавина на rll-локус бактериофага Т4 (гл. 28). просрлавин Благодаря способности интеркалировать между основаниями в двойной спирали ДНК профлавин может вызывать делеции или 26. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА II 1055 вставки нуклеотидов в геном во время репликации. Такое генетическое изменение приводит к образованию нефункционирующего белка из-за того, что рамка считывания кодонов сдвинута в точке делсции или вставки. В результате этого аминокислотная последовательность полностью меняется, начиная с точки делеции или вставки в сторону С-конца пептидной цепи, как показано на условном примере с делецией: считывание после делеции Phe- Lys- Pro- Phe- Cln- Lys- 1 Cly- Asn UUU ААА ссс 0UC CAG I AAG j 1 I GGU ? ? AAU ] 1 1 Phe- Lys- Pro- Ser I -Argj -Argj -Val Однако делеция трех нуклеотидов подряд приводит к образованию белка, в котором делетирована одна аминокислота. При этом рамка считывания для остальной части белка сохраняется. Если делеции (или вставки) нуклеотидов происходят не в соседних положениях цепи, то аминокислотная последовательность меняется только на участке между первым и последним изменением в полинуклеотидной цепи. Действительно, было показано, что введение путем кроссинговера в г11-ген фага Т4 трех делеции (или вставок) приводит к образованию функционально активного белка; две или одна делеция (или вставка) дают неактивный белок. Этот результат свидетельствует о том, что код является триплетным, т. е. должен считываться группами по три нуклеотида. Выяснение генетического кода, т. е. определение тринуклеотид-«ых последовательностей, характерных для каждой аминокислоты, стало возможным после обнаружения того, что синтетический полимер— poly(U) (гл. 7) может служить в качестве мРНК для синтеза полнфенилаланина в экстрактах Е. coli, способных к белковому синтезу. Среди 18 аминокислот, испытанных в этой системе, только фенилаланин дал соответствующий полипептид. Следовательно, принимая во внимание триплетность кода, тринуклеотид UUU является кодоном фенилаланина. В дальнейшем генетический код был расшифрован с помощью трех типов экспериментов: 1. Использование полинуклеотидов, синтезированных с помощью фермента полинуклеотидфосфорилазы. Этот фермент катализирует следующую реакцию: ? NDP ?—(NMP)„ -f ? Pj где NDP — любой рибонуклеозиддифосфат, a (NMP)/z — полимер, содержащий ? рибонуклеозидмонофосфатных остатков. Как было отмечено выше, poly(U) приводит к синтезу полифенилаланина. Poly (С) и poly (А) приводят к образованию полипролина и полили- 1056 HI. МЕТАБОЛИЗМ зина соответственно. Такие гомополимеры и сополимеры, полученные из смесей рибонуклеозиддифосфатов, были использованы для выяснения состава кодонов, соответствующих определенным аминокислотам; однако такой подход не позволяет определить последовательность оснований в кодоне. 2. Связывание тринуклеотидов известной последовательности и соответствующих тРНК с рибосомами. Poly(U) может связываться с рибосомами, образуя комплекс, связывающий только фенил-аланиновую тРНК. Аналогичным образом тринуклеотиды с известной последовательностью, связавшись с рибосомами, приводят к связыванию только определенных тРНК-Так, 5'-UUG-3' способствует связыванию лейциновой аминоацилированной тРНК и т. д. Наиболее эффективными тринуклеотидами являются такие, у которых свободны 3' и 2'-концевые гидроксидные группы, а 5'-гидро-ксидная группа фосфорилирована. Хотя изучение связывания тРНК в присутствии тринуклеотидов в большинстве случаев дает однозначный результат, некоторые отнесения кодонов были сомнительны либо вследствие низкого уровня связывания, либо из-за необходимости проведения эксперимента в нефизиологических условиях, в частности при высоких концентрациях Mg2+. 3. Однозначное отнесение кодонов с помощью сополимеров с известной нуклеотидной последовательностью. Представим себе рибосополимер, состоящий из многократно повторенных динуклео-тидов XY. Такой сополимер можно представить в виде последовательного ряда триплетов XYX и YXY, т. е. ?_?_^_?_?_?_^-?-? что — ?_? должно кодировать альтернирующую последовательность из двух аминокислот. Например, в том случае, если X и ?—это U и G, то на таком полинуклеотиде синтезируется альтернирующая последовательность (...цистеил-валил...). Аналогичные эксперименты были проведены с полинуклеотидами, содержащими повторяющиеся тринуклеотиды или тетрануклеотиды. Результаты многих экспериментов такого рода и изучение связывания тринуклеотидов позволили установить все триплетные кодоны, соответствующие всем 20 аминокислотам. Эксперименты с определенными сополимерами позволили также определить инициаторные кодоны и лучше понять условия, необходимые для точной трансляции в бесклеточной системе. Например, сополимер ...G—А—U —G—A—U—G—А—U—G—А—U—... должен кодировать полиметионин (AUG AUG AUG) и полиаспар-тат (GAUGAUGAU) при высоких концентрациях Mg2+ (0,05?). Третья рамка считывания (UGAUGAUGA) не дает полипептида, так как UGA — терминирующий кодон. Однако при более низкой 26. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. II 1057 концентрации Mg+2 (0,005 ?) синтез полипептида либо не идет совсем, либо идет очень слабо, если только в дополнение к met-TPHKMet не присутствует imet-TPHK™6'. В этом случае только полипептид fMet-Met-Met... синтезируется с заметным выходом. Аналогичным образом ...G-U-G-U-G-U-G-U... при высокой концентрации Mg+2 дает альтернирующий полипептид ...цистеил-валил..., как уже было отмечено выше, но при низкой концентрации магния синтез полипептида также практически не идет до тех пор, пока не добавлена imet-TPHK^et. В этом случае синтезирующийся полипептид имеет последовательность fMet-Cys-Val-Cys-Val-... . Это свидетельствует о том, что GUG может также кодировать ин |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 |
Скачать книгу "Основы биохимии. Том 2" (8.40Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |