Биологический каталог




Основы биохимии. Том 2

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

сов, ингибиторы отдельных специфических реакций сыграли большую роль при выделении стадий биосинтеза нуклеиновых кислот и белков. Некоторые из этих ингибиторов являются синтетическими соединениями, другие были впервые выделены из культу-ральных фильтратов различных организмов как антибиотики и использовались при попытках лечить инфекционные заболевания или ингибировать рост малигнизированных тканей. Соединения, которые ингибируют образование пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, косвенно блокируют образование нуклеиновых кислот; они описаны в гл. 24. Ингибиторы синтеза мРНК, которые блокируют ДНК-зависимую РНК-полимеразу, будут рассмотрены ниже. В этом

26. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. II

1053

разделе мы рассмотрим ингибиторы, которые являются антибиотиками и влияют на трансляцию мРНК. Обладая способностью специфически реагировать с рибосомими прокариот, некоторые из этих агентов получили широкое распространение при лечении инфекционных заболеваний.

Пуромицин, который структурно аналогичен аминоацил-тРНК, ингибирует синтез белка, маскируясь под аминоациладенозиновую часть аминоацил-тРНК и конкурируя с аминоацил-тРНК в качестве акцептора при реакции траиспептидации. После того как растущий пептид или формилметионин переносятся на аминогруппу пу-ромицина, вновь образованный пептидил- или формилметионилпу-ромицин покидает рибосому; это прерывает нормальный рост цепи, и неполная пептидная цепь, имеющая пуромициновый остаток на карбоксильном конце, уходит с рибосомы.

СНзч /СН3

?? ОН _ О ОН

0=С-СН-СН2—/ \—ОСН3 0=C-CH2R NH2 . NH2

пуромицин аминоацил-тРНК

Стрептомицин ингибирует синтез белка, связываясь с ЗОБ-субъ-единицей; стрептомицин-ЗОБ-комплекс образует менее эффективный и более лабильный инициаторный комплекс, диссоциация которого прерывает процесс трансляции. Связывание стрептомицина с ЗОБ-субъединицей также меняет эффективность и точность связывания аминоацил-тРНК с соответствующим кодоном в А-участке. Устойчивость к стрептомицину и, более того, зависимость от него возникают в результате мутационных изменений отдельных белков рибосомальной ЗОБ-субъединицы.

Тетрациклин ингибирует элонгацию полипептидных цепей, блокируя вхождение аминоацил-тРНК в ?-участок; растущая полипептидная цепь остается в Р-участке и может нормально реагировать с пуромицином.

Хлорамфеникол блокирует пептидилтрансферазную активность 50S-субъединицы в 70Б-рибосомах.

1054

III. МЕТАБОЛИЗМ

Циклогексимид, как предполагают, действует таким же образом, как и хлорамфеникол, на бОБ-еубъединицу в вОБ-рибосомах.

Эритромицин связывается с 50Б-рибосомной субъединицей и, вероятно, блокирует стадию транслокации, «замораживая» таким образом пептидил-тРНК в ?-участке. Мутации, приводящие к устойчивости к эритромицину, затрагивают один из белков 50S-субъединицы рибосом Е. coli.

Фусидовая кислота — стероид, который влияет на стадию транслокации после образования пептидной связи, вероятно, предотвращая расщепление GTP в сопряженной реакции расщепления GTP и транслокации с участием фактора EF-2.

Дифтерийный токсин специфически ингибирует синтез белков у эукариот, но не у прокариот. После того как интактный токсин попадает в клетку, он претерпевает расщепление трипсиноподобньгм ферментом, в результате чего образуется фрагмент, который блокирует транслокацию, оставляя растущую пептидильную цепь в ?-участке. Активным фрагментом токсина является фермент, который катализирует перенос ADP-рибозной части NAD+ на белок EF-2, таким образом блокируя его активность. Реакция ADP-рибо-зилирования обратима, и ADP-рибоза может быть удалена с EF-2 добавлением большой концентрации никотинамида.

дифтерийный

NAD+ + EF-2 ( *" аденозиндифо:форибозил-ЕР-2 -j- никотинамид

токсин

26.4. Генетический код

В связи с тем что в ДНК имеются только четыре типа оснований, а белки содержат 20 аминокислот, очевидно, что для кодирования аминокислоты необходимо более одного основания. Пара или дублет оснований может кодировать только 16 аминокислот (42); в связи с этим было предсказано, что кодон, т. е. нуклео-тндная последовательность, кодирующая аминокислоту, должен быть триплетным.

Самая первая экспериментальная проверка этой идеи заключалась в проверке последствий действия красителя профлавина на rll-локус бактериофага Т4 (гл. 28).

просрлавин

Благодаря способности интеркалировать между основаниями в двойной спирали ДНК профлавин может вызывать делеции или

26. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА II

1055

вставки нуклеотидов в геном во время репликации. Такое генетическое изменение приводит к образованию нефункционирующего белка из-за того, что рамка считывания кодонов сдвинута в точке делсции или вставки. В результате этого аминокислотная последовательность полностью меняется, начиная с точки делеции или вставки в сторону С-конца пептидной цепи, как показано на условном примере с делецией:

считывание

после делеции

Phe- Lys- Pro- Phe- Cln- Lys- 1 Cly- Asn

UUU ААА ссс 0UC CAG I AAG j 1 I GGU ? ? AAU ] 1 1

Phe-

Lys-

Pro-

Ser I -Argj -Argj

-Val

Однако делеция трех нуклеотидов подряд приводит к образованию белка, в котором делетирована одна аминокислота. При этом рамка считывания для остальной части белка сохраняется. Если делеции (или вставки) нуклеотидов происходят не в соседних положениях цепи, то аминокислотная последовательность меняется только на участке между первым и последним изменением в полинуклеотидной цепи. Действительно, было показано, что введение путем кроссинговера в г11-ген фага Т4 трех делеции (или вставок) приводит к образованию функционально активного белка; две или одна делеция (или вставка) дают неактивный белок. Этот результат свидетельствует о том, что код является триплетным, т. е. должен считываться группами по три нуклеотида.

Выяснение генетического кода, т. е. определение тринуклеотид-«ых последовательностей, характерных для каждой аминокислоты, стало возможным после обнаружения того, что синтетический полимер— poly(U) (гл. 7) может служить в качестве мРНК для синтеза полнфенилаланина в экстрактах Е. coli, способных к белковому синтезу. Среди 18 аминокислот, испытанных в этой системе, только фенилаланин дал соответствующий полипептид. Следовательно, принимая во внимание триплетность кода, тринуклеотид UUU является кодоном фенилаланина.

В дальнейшем генетический код был расшифрован с помощью трех типов экспериментов:

1. Использование полинуклеотидов, синтезированных с помощью фермента полинуклеотидфосфорилазы. Этот фермент катализирует следующую реакцию:

? NDP ?—(NMP)„ -f ? Pj

где NDP — любой рибонуклеозиддифосфат, a (NMP)/z — полимер, содержащий ? рибонуклеозидмонофосфатных остатков. Как было отмечено выше, poly(U) приводит к синтезу полифенилаланина. Poly (С) и poly (А) приводят к образованию полипролина и полили-

1056

HI. МЕТАБОЛИЗМ

зина соответственно. Такие гомополимеры и сополимеры, полученные из смесей рибонуклеозиддифосфатов, были использованы для выяснения состава кодонов, соответствующих определенным аминокислотам; однако такой подход не позволяет определить последовательность оснований в кодоне.

2. Связывание тринуклеотидов известной последовательности и соответствующих тРНК с рибосомами. Poly(U) может связываться с рибосомами, образуя комплекс, связывающий только фенил-аланиновую тРНК. Аналогичным образом тринуклеотиды с известной последовательностью, связавшись с рибосомами, приводят к связыванию только определенных тРНК-Так, 5'-UUG-3' способствует связыванию лейциновой аминоацилированной тРНК и т. д. Наиболее эффективными тринуклеотидами являются такие, у которых свободны 3' и 2'-концевые гидроксидные группы, а 5'-гидро-ксидная группа фосфорилирована. Хотя изучение связывания тРНК в присутствии тринуклеотидов в большинстве случаев дает однозначный результат, некоторые отнесения кодонов были сомнительны либо вследствие низкого уровня связывания, либо из-за необходимости проведения эксперимента в нефизиологических условиях, в частности при высоких концентрациях Mg2+.

3. Однозначное отнесение кодонов с помощью сополимеров с известной нуклеотидной последовательностью. Представим себе рибосополимер, состоящий из многократно повторенных динуклео-тидов XY. Такой сополимер можно представить в виде последовательного ряда триплетов XYX и YXY, т. е. ?_?_^_?_?_?_^-?-? что

— ?_?

должно кодировать альтернирующую последовательность из двух аминокислот. Например, в том случае, если X и ?—это U и G, то на таком полинуклеотиде синтезируется альтернирующая последовательность (...цистеил-валил...). Аналогичные эксперименты были проведены с полинуклеотидами, содержащими повторяющиеся тринуклеотиды или тетрануклеотиды. Результаты многих экспериментов такого рода и изучение связывания тринуклеотидов позволили установить все триплетные кодоны, соответствующие всем 20 аминокислотам.

Эксперименты с определенными сополимерами позволили также определить инициаторные кодоны и лучше понять условия, необходимые для точной трансляции в бесклеточной системе. Например, сополимер ...G—А—U —G—A—U—G—А—U—G—А—U—... должен кодировать полиметионин (AUG AUG AUG) и полиаспар-тат (GAUGAUGAU) при высоких концентрациях Mg2+ (0,05?). Третья рамка считывания (UGAUGAUGA) не дает полипептида, так как UGA — терминирующий кодон. Однако при более низкой

26. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. II

1057

концентрации Mg+2 (0,005 ?) синтез полипептида либо не идет совсем, либо идет очень слабо, если только в дополнение к met-TPHKMet не присутствует imet-TPHK™6'. В этом случае только полипептид fMet-Met-Met... синтезируется с заметным выходом. Аналогичным образом ...G-U-G-U-G-U-G-U... при высокой концентрации Mg+2 дает альтернирующий полипептид ...цистеил-валил..., как уже было отмечено выше, но при низкой концентрации магния синтез полипептида также практически не идет до тех пор, пока не добавлена imet-TPHK^et. В этом случае синтезирующийся полипептид имеет последовательность fMet-Cys-Val-Cys-Val-... . Это свидетельствует о том, что GUG может также кодировать ин

страница 104
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 2" (8.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)