Биологический каталог




Основы биохимии. Том 2

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

ggcgc g ? с a t V V V

Рис. 26.19. Нуклеотндная последовательность ДНК, соответствующей гену супрес-сорной тирозиновой тРНК Е. coli. Промоторная последовательность простирается от —56 до 1 остатка, предшественник тРНК — от 1 до 126 остатков и терминатор-ная последовательность — от 126 до 151 остатка. (Courtesy of professor ?. G. КЬо-

rana.)

состоит из 86 нуклеотидов (рис. 26.8). Остальная часть гена состоит из промоторного участка длиной 56 остатков ,на одном конце и терминаторного участка длиной 25 остатков на другом конце. Таким образом, функциональный ген тирозиновой тРНК, полный синтез которого был осуществлен, представляет собой двухнитевой дуплекс ДНК длиной 207 нуклеотидов (рис. 26.19). Его полная нуклеотндная последовательность была установлена сначала в результате определения первичной структуры предшественника тРНК, а затем определением последовательности дезокеинуклеоти-дов регуляторных элементов (промоторного и терминаторного участков).

Стратегия, использованная при синтезе части гена, кодирующей предшественник тРНК, включает три основные стадии:

. 1. Химический синтез коротких дезоксиолигонуклеотидных фрагментов, соответствующих обеим нитям дуплексной ДНК- Синтез этих олигонуклеотидов проводится либо постадийной полиме-

36·

1088

III. МЕТАБОЛИЗМ

ризацией мононуклеотидов, либо конденсацией коротких (ди-, три-и тетрануклеотидов) олигонуклеотидных фрагментов с образованием олигонуклеотидных цепей необходимой длины. Для этой цели используется несколько конденсирующих агентов; наиболее эффективными оказались карбодиимиды (гл. 6) и сульфонилхлориды. Так как эти реагенты легко реагируют с различными группами нуклеотидов (3'- и 5'-гидроксидные группы дезоксирибозы, аминогруппы гетероциклических оснований, фосфатные группы), то были разработаны подходящие защитные группы для предотвращения изменений этих реакционноопоеобных групп. Такими группами являются тритильная и /г-метокситритильная для защиты 5'-гидро-ксидной группы, бензоильная и анизоильная группы для защиты экзоциклической аминогруппы цитозина. Стадии, необходимые для синтеза тринуклеотида рАрАрС, приведены на рис. 26.20.

2. Одновременное сшивание нескольких фрагментов с помощью ДНК-лигазы. В каждом случае фрагменты выбирают таким образом, чтобы оставались комплементарные однонитевые концы, 'позволяющие сплавление коротких дуплексов друг с другом в нужной последовательности и последующее ферментативное лигирование.

3. Связывание дуплексов, опять за счет однонитевых перекрываний концов, с образованием дуплекса ДНК, соответствующего предшественнику тирозиновой тРНК (рис. 26.21). Завершение гена осуществлено в результате синтеза промоторной и термина-торной последовательностей и их слияния по соответствующим концам в структурную часть молекулы, содержащую 126 нуклеотидов.

Синтетический ген супрессорной тирозиновой тРНК полностью активен после включения в бактериофаг ?, содержащий нонсенс-

RO

N

г-он + в

??-?-0. I \

о

-ОАс

1. DCC или ароматический сулъфонилхлормй

2 ОН-

3. Хроматография

An С

I +

HO-P-0

о- N

-ОАс

1. Конденсация

2. OH-

3. Хроматография

? ?

-оН

"? \ I

An

? ? С

RO

Ч.

-ОН

? ? ? ?

Рис. 26.20. Стадии химического синтеза тринуклеотида d-pTpTpC. Обозначения: Ас — ацетил; Ап — анизоил; С —цитозин; DCC — дициклогексилкарбодинмид; R —тритил; Т —тимин. (Khoraha ?. С, Proc. 7th Int. Cong. Biochem., Tokyo,

1967.)

26. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. II

1089

26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

.-(5)-1 .-О)-¦¦ (1)-.

т—с—с—a—a—g—с—?—? a—g—g—а —a—g—g—g—g—g—? g-g-t-g-g-t -(5)

? ? ? ? 1 ? I I I I I I I I ? ? I I I I I I

?—с—g—а—а—?—с—с—?— ?—с с-с-с-с-а-с-с-а-с-с-а -(31 ?-(4)-' ¦-(2)-'

51 50 49 48 47 46 45 44 43 42 41 40 39 39 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23

,-(9)-1 ?-(7)-1

a—g—а—с—g—g—с—a—g—? a—g—с—?—g—a—a—g—с-т -(57

II I I I I ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? I

с—?—а—а—а—т—с—т—g—с с—g—т—с—а—т—с—g—а—с ?—т—с—g—a—a—g—g—? -(37 ?-(10) - ' 1--(8)-"-(61 ¦

70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 59 57 56 56 54 53 52 51 50 49 48 47

,-(13)-. ?-(11)--1

g—?—?—?—с—с—с—?—с—g ?—с—?—g—a—g—?—?—?—? -(51 I I I I I I I I I I i I I I i c-g-g-c-c-a-a-a-g-g g-a-g-c-a-g-a-c-t -(31 '-(14)-"-(12)-1 j '

94 93 92 91 90 89 88 87 66 85 84 63 82 81 80 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 68 68 67

?-(18)-1 ?-(15)-1-1

g-c-a-c-c-a-c-c-c-c-c a-a-g-g-g-c-t-c^g-c-c-g -(51 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I a-t-t-a-c-c-c-g-t g-g-t-g-g-g-g-t-t-c-c c-g-a-g -(31 ?-(191-' ¦-(17)-1 1-(16)-1

112 110 108 106

104

(22)-

102

100 99 98 97 96 95 94 93 92 91 90 -|3l

-1 I-(201-,

t-c-c-g-g-t-c-a-t t-t-t-c-g-t-a-a-t-g -(51 I I I I I I I I I I I I I I g-g-a-g-c-a-g-g-c-c a—g—t—а—а—а—а—с—с ¦-(23)-"-(211-1

126 124 122. 120 118 116 114 112 110

I-(26)-1 ?-(24)-,

c-g-a-a-g-g g-c-t-a-t-t c-c-c t-c-g -(5*1 I I I I I I I I I I I I I

g-c-t-t-c-c-c-g-a-t-a-a-g -(31 1-(251-1

Рис. 26.21. Расположение 26 олигодезоксирибонуклеотидных фрагментов, синтезированных химически для полного синтеза ДНК, соответствующей предшественнику тирозиновой супрессорной тРНК Е. coli. (Khorana ?. G. et al., J. Biol. Chem,

251, 565, 1976.)

мутацию (разд. 26.4.3.1), что подтверждается восстановлением способности мутаитного бактериофага размножаться в соответствующей клетке-хозяине.

26.6.4. Контроль белкового синтеза у эукариот

Несмотря на то что здесь были рассмотрены регуляторные гены и репрессорные механизмы микроорганизмов, можно предполагать,

1090

III. МЕТАБОЛИЗМ

что они существуют также и у более сложных организмов. Дифференцированные клетки многоклеточных организмов синтезируют -существенно различные количества разных белков, несмотря на идентичность заложенной в них генетической информации. Явления индукции и репрессии могут быть причиной некоторых различий в ¦скоростях метаболических превращений и относительной важности различных метаболических путей для клеток различной дифференцировки из одного организма.

Имеются некоторые указания на последовательное образование ряда белков. На некоторых специфических областях хромосом, видимых как пуффы, РНК синтезируется в определенной временной последовательности во время эмбрионального развития или при стимуляции экдизоном (разд. 3.4.5.7), одним из гормонов насекомых. Примером контроля синтеза белка во время эмбрионального развития может служить то, что некоторые неиндуцибельные белки не обнаруживаются на ранних стадиях развития, но появляются на поздних. Так, у эмбрионов имеется либо только фетальный гемоглобин (HbF = ot2Y2), либо с небольшой примесью НЬА(«2Рг)-Это свидетельствует о том, что ?-цепь не синтезируется с заметной скоростью. У новорожденных образование у-цепи репрессировано и ускорено образование ?-цепи (гл. 31).

"Хотя для понимания механизма белкового синтеза основные данные были до сих пор получены для прокариот, в случае эукариот работают те же основные принципы и аналогичные участники. С другой стороны, регуляция белкового синтеза у эукариот гораздо сложнее, чем у прокариот. В связи с тем что геномы эукариот очень велики и содержат высокоповторяющиеся и умеренноповто-ряюшиеся последовательности, возникает принципиальный вопрос— должна ли РНК-полимераза и регуляторные молекулы просматривать всю последовательность огромного генома для того, чтобы найти соответствующую мишень, либо имеются специфические механизмы, например структурные вариации хроматина, которые ограничивают область такого поиска? Кроме того, места транскрипции и трансляции у эукариот физически разделены в клетке. Наконец, есть много оснований предполагать, что для широкой дифференциации клеток, характерной для высших эукариот, необходима сложная иерархия взаимосвязанных регуляторных реакций.

Первичными регуляторами многих метаболических процессов у млекопитающих являются гормоны. Многие гормоны, включая инсулин, тестостерон, тироксин, гормоны роста (соматотропин) и адренокортикальные стероиды, при введении in vivo существенно изменяют скорость синтеза белков, причем не только в специфических тканях. Некоторые из этих гормональных эффектов весьма быстры — через два часа после инъекции крысам адренокортикаль-яых стероидных гормонов наблюдается значительное увеличение

26. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. II

1091

активности и количества печеночной тирозин-глутамат-аминотранс-феразы. Влияние гормонов на синтез белка проявляется не только в изменении количества различных белков после инъекции специфического гормона, но и в синтетической активности бесклеточной системы, полученной из тканей этого животного. Данные исследований последнего типа лежат в основе предположения о том, что некоторые гормоны, например тироксин и адренокортикальные гормоны, проявляют свое влияние через изменение скорости синтеза РНК, включая гетерогенную ядерную РНК. Это сопровождается изменением активности РНК-полимеразы и количества шероховатого эндоплазм этического ретикулума, обнаруживаемого в клетках-мишенях при электронной микроскопии. Эти данные указывают на то, что эффективные гормоны могут: 1) некоторым образом изменять степень функционирования генома как матрицы в системе синтеза РНК и/или 2) изменять скорость переноса аминоацил-тРНК на рибосомы и включение аминокислот в белки (гл. 41).

ДНК клеток эукариот полностью ассоциирована с гистонами и другими белками (гл. 25). Хотя точная роль этих белков до сих пор неизвестна, было предположено, что гистоны служат не только для защиты ДНК, как белки оболочки многих вирусов, но также, возможно, выполняют некоторые регуляторные функции при транскрипции. Свидетельством в пользу последнего предположения является обнаружение того, что гистоны могут претерпевать обратимые модификации во время периода активного роста или гормональной стимуляции метаболизма (гл. 25).

В семенниках костистых рыб незрелые сперматогонии содержат гистоны, в то время как в

страница 111
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 2" (8.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)