железо и кислотно-лабильный сульфид. Фермент обратимо диссоциирует на мономеры (? ~200 000), обладающие каталитической активностью. Имеются данные о наличии еще меньших субъединиц, обладающих ферментативной активностью, образующихся при действии протеиназ; при этом, вероятно, происходит отщепление каталитической части фермента от его фрагмента, связанного с мембраной. Синтез нитратредуктазы индуцируется нитратом и подавляется NHt.

На второй стадии процесса, катализируемой нитритредуктазой (разд. 13.5.3), осуществляется перенос шести электронов

NC? + 8H+ + 6e -»- NHj- + 2H20

Как и в других процессах с мультиэлектронным переносом (восстановление 02, N2, SOl-), промежуточные продукты обнаружить we удается. Простетическими группами нитритредуктазы являются FMN, FAD, Fe2S2 и сирогем (разд. 13.5.2). Сирогем является непосредственным восстановителем нитрита.

Восстановителем при функционировании нитритредуктазы в растениях и водорослях выступает ферредоксин; в зеленых растениях ферредоксин может восстанавливаться либо фотосинтетиче-ски, либо за счет NADPH (в присутствии флавопротеидного фермента ферредоксин-А'АОРН-оксидоредуктазы). Таким образом, железосеропротеид ферредоксин может служить донором электронов для железосерной группировки нитритредуктазы; далее электрон переносится на нитрит через сирогем. Нитритредуктазы некоторых грибов, имеющие более высокую молекулярную массу, содержат связанный флавин, который ускоряет восстановление сирогема восстановленным пиридиннуклеотидом.

20. МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ. I

837

20.2. Фиксация аммиака

Аммиак независимо от пути его образования включается в состав органических соединений в результате трех главных реакций, характерных для всех живых организмов. Эти реакции приводят к образованию глутаминовой кислоты, глутамина и карбамоилфосфата. Дальнейшее использование азота карбамоилфосфата ограничено двумя возможными путями; в одном из них единственный атом азота поставляется для синтеза пиримидинов (разд. 24.1.5), а в другом — для синтеза аргинина (разд. 21.4.3.5). Источником же практически всех атомов азота, входящих в состав аминокислот или других органических соединений, являются (прямо или косвенно) глутамат или амидная группа глутамина; лишь в некоторых ферментативных реакциях вместо глутамина может использоваться аммиак.

У таких бактерий, как Е. coli и В. megaterium, и у растений функционируют глутаматдегидрогеназы, специфичные к NADPH:

?-кетоглутарат + NH^ + NADPH -<—глутамат + NADP+ + Н20 (1)

Образовавшийся глутамат используется глутаминсинтетазой для фиксирования второй молекулы NH3; в результате образуется глутамин:

глутамат + NH3 + АТР -»- глутамин + ADP + Pf (2)

Далее из глутамина и а-кетоглутарата в результате действия глутаматсинтазы может происходить образование дополнительного количества глутамата:

?-кетоглутарат + глутамин + NADPH + Н+ -*¦ 2 глутамат + NADP+ (3)

У Е. coli в условиях, при которых количество аммиака ограничено, большая часть глутамата несомненно синтезируется по реакции (3); следует, однако, иметь в виду, что предварительно по реакции (1) должно быть синтезировано определенное количество глутамата, необходимого для образования глутамина по реакции (3). Далее реакции (2) и (3) могут осуществляться в циклическом режиме, приводя в итоге к образованию глутамата из кетоглутарата.

20.2.1. Глутаматдегидрогеназа, реакция (1) »

Фермент из Е. coli является гексамером, состоящим из 6 субъединиц, каждая из которых имеет А4~50 000. Для роста мутантов Е. coli, лишенных активной дегидрогеназы, необходимы небольшие количества глутамата.

838

III. МЕТАБОЛИЗМ

Глутаматдегидрогеназы различных организмов существенно отличаются, известно также несколько различных механизмов регуляции активности этих ферментов. Свойства ферментов млекопитающих и других позвоночных описаны в гл. 21. Свойства же втих ферментов у Neurospora crassa и Saccharomyces (дрожжи) рассмотрены ниже.

N. crassa может расти на среде, содержащей глюкозу, следы биотина и смесь неорганических солей, включающую (NH4)2S04. На этой среде организм вырабатывает глутаматдегидрогеназу, ¦специфичную к NADPH [см. реакцию (1)] и, по-видимому, обеспечивающую синтез глутамата, необходимого для роста. Глута-матсинтаза не была обнаружена. NADPH-специфичная дегидрогеназа N. crassa — сходна с соответствующим ферментом из Е. coli. Она состоит из 6 идентичных субъединиц, каждая из которых содержит по 452 аминокислотных остатка. Сопоставление расшифрованных участков последовательности указывает на определенную гомологию с глутаматдегидрогеназами из печени быка « кур.

Если к культуре N. crassa добавить глутамат и уменьшить в среде количество глюкозы, то синтез NADPH-специфичного фермента полностью подавляется; вместо него образуется NAD-cne-цифичный фермент. Функция этого фермента заключается, вероятно, в дегидрогенировании части имеющегося в среде глутамата, обеспечивая, таким образом, образование ?-кетоглутарата, вступающего в цикл трикарбоновых кислот, и NADH —¦ донора водорода для окислительного фосфорилирования: в конечном счете это обеспечивает образование АТР. NAD-специфичный фермент отличается от NADP-специфичного фермента по свойствам и аминокислотной последовательности. Он имеет ??-~460000 и состоит из четырех идентичных субъединиц, причем каждая содержит более 1000 аминокислотных остатков. Таким образом, у данного организма контроль процессов усвоения азота и обеспечения энергетических потребностей регулируется путем биосинтеза или репрессии двух различных глутаматдегидрогеназ.

20.2.2. Глутаматсинтаза, реакция (3)

Этот фермент, выделенный из Е. coli (??~800000), состоит из субъединиц двух типов. Субъединицы одного типа содержат негемовое железо, лабильный сульфид, FAD и FMN, субъединицы другого типа имеют ??~55 000. Мутанты Е. coli и В. Megaterium, лишенные активной синтазы, нуждаются для роста в большом количестве глутамата. На этом основании было высказано предположение о том, что катализируемая синтазой реакция обеспечивает в основном синтез глутамата в этих организмах. Подобная же ситуация с синтезом глутамата имеет, вероятно, место также

20. МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ. I

839

и у высших растений, поскольку они содержат относительно небольшие количества NADPH-специфнчной глутаматдегидрогеназы и большее количество глутаматсинтазы.

20.2.3. Глутаминсинтетаза, реакция (2)

Глутаминсинтетаза Е. coli выделена в высокоочищенном состоянии. Регуляция активности этого фермента сложна, схема регуляции приведена на рис. 20.2. Фермент (?? 600 000) состоит из 12 идентичных субъединиц; он инактивируется в результате переноса 5'-аденилильной группы от АТР на фенольную гидроксидную группу специфического остатка тирозина (с образованием фосфодиэфирной связи) в каждой из полипептидных цепей. Эта реакция, называемая аденилирсванием, катализируется ферментом АТР : глутаминсинтетаза—аденилилтрансферазой (?~ 130 000). Реактивация аденилированной глутамннсинтетазы осуществляется путем фосфоролитического расщепления аденилилтирозильной связи с образованием ADP и активного фермента; этот процесс катализируется той же самой аденилилтрансферазой при участии одной из форм регуляторного белка, который обозначается Ри (?? 50 000).

Аденилилтрансфераза является, следовательно, бифункциональным катализатором, обеспечивающим как аденилирование, так

Рис. 20.2. Схема взаимосвязи между ковалентными модификациями Рп регуляторного белка и глутамннсинтетазы и регуляция этих модификаций различными метаболитами. АТаза — АТР: глутаминсинтетаза—аденилилтрансфераза; UT—· уридилилтрансфераза, UR — уридилудаляющий фермент; GS — глутаминсинтетаза; KG — ?-кетоглутарат; Gin — глутамин; (+)—стимуляция; (—)—ингибирование. Рп соответствует в тексте РцА, a PnUMP — Pud, т. е. формам Рп, стимулирующим аденилирование и дезаденилирование соответственно. \Stadman Е. R.. Ginsburg ?., p. 755 in P. О. Boyer, ed., The Enzymes, vol. X, 3d ed. Academic Press,

Inc., New York, 1974]

840

III. МЕТАБОЛИЗМ

и дезаденилирование глутаминсинтетазы; какая именно из реакций катализируется, зависит от регуляторного белка Рц. Последний может находиться в двух формах, способных к взаимопревращению; немодифицированная форма стимулирует аденилирование и обозначается поэтому Рид, модифицированная форма, Рщь стимулирует только дезаденилирование. При превращении Рид в Pud уридильная группа от UTP переносится на белок Рц. Эта реакция катализируется специфической уридинилтрансферазой (М 160 000). в качестве кофакторов выступают АТР, а-кетоглута-рат, а также либо Mg2+, либо Мп2+.

Регуляция обеих функций АТР : глутаминсинтетаза—адени-лилтрансферазы (АТазы) при действии UTP, ?-кетоглутарата и Рц позволяет предотвратить протекание бесполезного цикла, в котором происходил бы фосфоролиз АТР с образованием ADP и PPi, и, следовательно, происходила бы значительная потеря свободной энергии:

АТаза. РПА. Ме2+

ATP-f-глутгмиксинтетаза--*¦

->¦ глутаминсинтетаза-AMP+ РР, -»- 2Pj

АТаза, PjID, Ме2+

глутаминсинтетаза ¦ АМР + Р,- -—*- глутаминсинтетаза -f- ADP

сумма: АТР ¦-*¦ ADP+Pi

На синтез самой глутаминсинтетазы в Е. coli и ее активность отрицательно влияет присутствие конечных продуктов метаболизма глутамина, для биосинтеза которых используется амидная группа глутамина. В число этих многочисленных соединений входят триптофан, гистидин, СТР, AMP, GMP, глкжозамин-6-фосфат, NAD, аопарагин, глутамат и карбамоилфосфат. Кроме того, тормозящее действие на активность фермента оказывают глицин, аланин и серин.

Сложный контрольный механизм, регулирующий у Е. coli активность глутаминсинтетазы, не является универсальным для бактерий. Так, очищенный фермент из В. subtilis, по-видимому, не контролируется путем аденилирования, он не может также служить субстратом для глутаминсинтетаза—аденнлилтрансферазы. Глутаминсинтетаза животных тканей рассматривается в следующей главе.

Глутамин занимает центральное место в азотистом обмене. Он является не только составной частью многих белков, но служит также источником азота при биосинтезе упомянуты