рибонуклеотидов до дезоксирибонуклеотидов было сделано на основе исследований, в которых цитидин, иС-меченный как по ядру, так и по сахарному остатку, вводили крысам. Было обнаружено, что удельная радиоактивность цитозина и дезоксирибозы в ДНК такая же, что и в инъецированном цитидине. Это свидетельствует о том, что превращение рибозы в дезоксирибозу идет без расщепления связи рибозы с пиримидином.

Механизм этого превращения был выяснен сначала при изучении восстановления рибонуклеотидов в экстрактах Е. coli. Один фермент — рибонуклеозид-дифосфат-редуктаза — катализирует восстановление всех четырех рибонуклеозиддифосфатов ADP, GDP, CDP и LJDP в их дезоксипроизводные dADP, dGDP, dCDP и dUDP соответственно. Этот фермент (М 245 000) состоит нз двух субъединиц: В1 (А1 160 000) и В2 (М 78 000). Субъединица В2 состоит из двух идентичных полипептидных цепей и содержит не-гемное железо; В1 состоит из двух неидентичных полипептидов. Механизм восстановления включает атаку гидрид-ионом Н~ по атому С-2' рибозного остатка, что приводит к замещению гидр-оксильной группы у С-2 на атом водорода без изменения конфигурации.

Источник восстанавливающей способности рибонуклеозид-ре-дуктазы in vivo неизвестен. Однако было показано, что in vitro активны два донора водорода. Одним является маленький серосодержащий белок тиоредоксин (разд. 20.4.1.1) (711 12 000), две сульф-гидридные группы которого окисляются с образованием днсуль-фидного мостика. Тиоредоксин может быть возвращен в восстановленную форму с помощью NADPH и тиоредоксинредуктазы, ????-рая представляет собой флавопротеид, содержащий два моля фла-винадениндинуклеотида на моль фермента (М 68 000). Вторым донором водорода является восстановленный глутатион, который работает в присутствии нового белка — глутаредоксина. Окисленный глутатион может быть возвращен в активное восстановлен-

S84

III. МЕТАБОЛИЗМ

ное состояние с помощью глутатионредуктазы, сопряженной с NADPH (разд. 13.2).

Активность рибонуклеозид-дифосфат-редуктазы аллостерически регулируется нуклеозидтрифосфатами, одни из них работают как стимуляторы, другие—-как ингибиторы. Так, восстановление CDP и UDP сильно стимулируется АТР (рис. 24.2), а восстановление ADP и GDP стимулируют dGTP и dTTP. dATP ингибирует восстановление всех четырех рибонуклеозиддифосфатов.

Общая система эффекторов и ингибиторов делает возможным сбалансированное поступление восстановленных дифосфатов и, следовательно, трифосфатов, непосредственных предшественников синтеза ДНК (гл. 25).

ингибирование всех субстратов

активация всех четырех еифосфатов

dATP

dTTP рибонуклеоэиЭ-Эифосфат-реЭуктаза

АТР

dGTPJ активации

ADP + GDP

активация CDP + UDP

Рис. 24.2. Схематическое изображение аллостерического влияния нуклеозидтри-фосфатов на рибонуклеозиддифосфатредуктазу Е. coli [Larsson ?., Reichard P., J. Biol. Chem., 241, 2540, 1966].

Редуктазные системы, выделенные из различных животных клеток, имеют такие же свойства, что и описанная выше система из Е. coli.

Другая система была обнаружена у различных видов Lactobacillus и Euglena. Перечислим основные характеристики последних систем. 1) Предпочтительными субстратами служат рибонуклео-зидтрифосфаты, АТР, GTP, СТР и UTP, восстановление которых катализируется одним ферментом. 2) Дигидролипоат может служить донором водорода, хотя настоящий восстановитель до сих пор не идентифицирован. 3) 5,6-Диметилбензимидазолкобаламид-ный кофермент (кофермент витамина ??2, гл. 50) является необходимым компонентом системы. 4) Mg2+ и АТР (dATP) стимулируют восстановление СТР и ингибируют восстановление UTP и GTP. 5) Различные дезоксирибонуклеозидтрифосфаты работают как эффекторы, стимуляторы и ингибиторы: их действие лишь в деталях отличается от действия на систему из Е. coli.

24. МЕТАБОЛИЗМ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

985

24.1.7.1. Образование тимидиновых нуклеотидов

dUMP, непосредственный предшественник dTMP, образуется при гидролизе UTP, катализируемом дезоксиуридинтрифосфатди-фосфогидролазой (dUTPa3ofl).

дезоксиуридин-5'-трифосфат + Н20 -*¦ дезоксиуридин-5'-фосфат + PPi

Эта реакция служит также для предотвращения включения урацила в ДНК (гл. 25).

Дезаминирование dCMP дезоксицитидилатгидролазой также приводит к образованию dUMP. В приведенных ниже формулах

Г2 ?

I II + н20-> I II + NH3

о=с гн о=с ^CH

? ? I I

d-рибозо-Р d-рибозо-Р Эезоксицити0ин-5'-фосфвт ЭеэоксицриЭин- S-фосфат

d-рибозо-Р отражает дезоксирибозо-5'-фосфат.

Этот фермент, присутствующий в печени, также катализирует дезаминирование метил- и оксиметилдезоксицитидиловых кислот.

5'-метилдезоксицитидин-5'-фосфат -j- Н20 -»- тимидин-5'-фосфат -|- NH3

5-оксиметилдезоксицитидин-5'-фосфат + Н20 -»-

5-оксиметилдезоксиуридин-5'-фосфат -f- NH3

В присутствии Са2+, Mg2+ или Mn2+ dCTP является аллостерическим активатором этого фермента, a dTTP — ингибитором. Метилирование dUMP катализируется тимидилатсинтетазой.

дезоксиуридин-5' -фосфат -f- №,10-метилентетрагидроф' -»¦ тимидин-5'-фосфат -f- дигидрофолат

Mg2 юлат--

Тетрагидрофолат служит как источником углерода, так и непосредственным донором водорода в этой сложной реакции. Образующийся дигидрофолат восстанавливается до тетрагидрофола-та в сопряженной с NADP реакции, катализируемой дигидрофо-латредуктазой.

29—1358

Е86 III. МЕТАБОЛИЗМ

Аналогичная реакция, но без восстановления идет при образовании 5-оксиметилдезоксицитидин-5'-фосфата из СМР при инфицировании Е. coli бактериофагами Т2, Т4 или Т6 (гл. 28).

NHZ

I

N СН

I II

N5' -метпилентетрагиЭрофолиевая , 0=С /СН ·->

кислота

d-рибозо-Р ЭеэоксицитиЭи н- 5 - фосфат

N С—СН,ОН _| II

тетрэгийрофолмевая кислота + \

^сн

d-рибозо-Р 5-оксиметил&езоксмиитиаин-5-фосфат

dTMP может также образовываться по запасному пути из тимина при участии тимидинфосфорилазы и тимидинкиназы.

тимин -j- дезоксирибозо-1 -фосфат .< А тимидин-j-Pj тимидин -{- АТР -> тимидин-5'-фосфат + ADP

Уровень тимидинкиназы резко возрастает при инфицировании клеток некоторыми вирусами или в условиях повышенной скорости роста, например при регенерации печени. Этот фермент регулируется аллостерически — ингибируется dTTP и стимулируется различными дезоксирибонуклеозиддифосфатами.

Образование дезоксирибонуклеозидди- и трифосфатов из монофосфатов идет при помощи специфических дезоксирибонуклеотид-киназ и неспецифических нуклеозиддифосфаткиназ, как описано для рибонуклеотидов (разд. 24.1.3). Общая схема основных взаимопревращений пиримидиновых дезоксирибонуклеотидов приведена на рис. 24.3.

dTTP

dCTP ? dUTP-, ?

I dCDP 1 UDP —> dUDP

? ? /

dCMP -> dUMP -

?

dTDP

?

dTMP <—шимиЭин <— тимин

Рис. 24.3. Общая схема основных взаимопревращений пиримидиновых дезоксирибонуклеотидов.

24. МЕТАБОЛИЗМ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

987

24.1.8. Регуляция синтеза нуклеотидов

Из вышесказанного ясно, что раздельные регуляторные механизмы осуществляют контроль за образовавшем пуриновых нуклеотидов (разд. 24.1.4), пиримидиновых нуклеотидов (24.1.5) и дезоксирибонуклеотидов (разд. 24.1.7). Рибонуклеозидтрифосфаты используются при образовании всех типов РНК (гл. 26), а дезокси-нуклеозидтрифосфаты являются непосредственными предшественниками биосинтеза ДНК (гл. 25). То, что свободные дезоксирибо-нуклеозидтрифосфаты присутствуют в клетках в очень малой концентрации, свидетельствует о том, что синтез дезоксинуклеотидов является скоростьлимитирующей стадией при синтезе ДНК- Таким образом, сбалансированные рост и размножение клеток нуждаются в синтезе большого количества нуклеозидтрифосфатов, которые должны поступать в нужном соотношении. Непосредственным источником энергии при образовании всех этих соединений является АТР; регулирование образования АТР зависит от энергетических потребностей клетки и находится под контролем различных механизмов. Однако доступность АТР однозначно определяет скорость образования всех рибо- и дезоксирибонуклеозид-трифосфатов, так как 5-фосфорибозил-1-пирофосфат является исходным веществом при образовании всех нуклеотидов и большие количества АТР необходимы для образования этого ключевого соединения. Фермент, катализирующий синтез 5-фосфорибозил-1-пирофосфата, сильно ингибируется ADP и GDP, что ограничивает синтез этого ключевого соединения при уменьшении энергоснабжения клетки. Влияние ADP как отрицательного эффектора гораздо сильнее, чем GDP. Триптофан и гистидин оказывают слабое влияние, хотя PRPP является предшественником синтеза этих аминокислот (гл. 21).

24.1.9. Образование нуклеотидных коферментов

Все рибонуклеотиды, обнаруженные в РНК, играют и другую важную роль в метаболизме. Так, были обнаружены реакции, в которых участвуют адениловая, гуаниловая, уридиловая, цитидило-вая и тимидиловая кислоты и соответствующие ди- и трифосфаты. Биосинтез и роль этих соединений были рассмотрены ранее. Также было обращено внимание на нуклеотиды, содержащие остатки, не обнаруженные в нуклеиновых кислотах, — никотинамид, флавин и пантотеновую кислоту. Биосинтез нуклеотидов, содержащих эти остатки, нуждается, как правило, в АТР.

24.1.9.1. Флавиновые нуклеотиды

Рибофлавин — 7,8-диметил-10-(1'-О-рибитил)изоаллоксазин — (гл. 50) является необходимым компонентом пищи млекопитаю-

29*

988

III. МЕТАБОЛИЗМ

щих. Как уже обсуждалось, он функционирует в виде моно- или динуклеотида в качестве простетической группы ряда ферментов. Флавинмононуклеотид (рибофлавин-5'-фосфат) образуется нз рибофлавина и АТР в ходе реакции, катализируемой флавокиназой

Mg2+

рибофлавин -j- АТР ->- флавинмононуклеотид (FMN) -(- ADP

Флавинадениндинуклеотид образуется из мононуклеотида с помощью обратимой реакции, катализируемой флавиннуклеотидфосфо-рилазой

Mg2+

флавинмононуклеотид -f- АТР < > флавинадениндинуклеотид (FAD) + PPi

24.1.9.2. Пиридиннуклеотиды

Никотинамидадениндинуклеотид (NAD) (разд. 12.1.1) содержит никотинамид, важный компонент пищи млекопитающих (гл. 50). Путь образования de novo никотиновой кислоты из триптофа