Биологический каталог




Основы биохимии. Том 2

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

7), вероятно, путем расщепления и воссоединения фосфодиэфириой связи. Такие раскручивающие белки, или «расплетазы», могут облегчить раскручивание при расплетании двух цепей во время репликации кольцевой молекулы ДНК. Были также обнаружены ферменты, названные ДНК-гира-зами, которые катализируют образование супервиткав в кольцевой ковалентно замкнутой ДНК.

Репликация линейной молекулы ДНК бактериофага Т7 также начинается в одной точке и идет одновременно' в обе стороны. Эта точка отстоит от одного конца молекулы ДНК иа 6500 нар оснований. Из-за асимметричного расположения точки начала репликации на ДНК сначала образуется «глаз» из двух реплнкацион-¦ных вилок, а затем, когда одна из вилок достигает конца ДНК, возникает ?-образная форма, до тех .пор пока не кончится репликация и во второй вилке (рис. 25.3).

Начало репликации в одном или обоих дочерних дуплексах можно инициировать до того, как закончится репликация родительской Т7 ДНК, так что 'более чем две вилки могут работать одновременно на одном промежуточном репликационном комплексе. Это дает возможность быстрее увеличивать количество реп-

1008

III. МЕТАБОЛИЗМ

лик одной родительской ДНК без увеличения скорости продвижения вилок или инициации репликации в других точках молекулы ДНК фата Т7. Аналогичное ускорение активации инициации репликации наблюдается, в определенных условиях, и для кольцевой хромосомы Е. coli.

Скорость движения вилки при репликации эукариотных хромосом почти на порядок ниже, чем у Е. coli, хотя их очень длинная молекула ДНК (табл. 7.4) может быть реплицирована за более короткое время, чем необходимо для репликации хромосомы Е. coli. Большая скорость репликации достигается благодаря последовательному расположению точек инициации, на каждой из которых образуется две репликационные вилки, двигающиеся

О

форма „глаза"

Y-образная форма

О

4--------

+

t--------

Рис. 25.3. Двунаправленная репликация линейной ДНК бактериофага Т7. Репликация начинается в точке О, отстоящей от одного конца на 6500 пар оснований, й образует форму «глаза» и ?-образную форму. Последняя диаграмма иллюстрирует активацию репликации в одном из дочерних дуплексов до завершения репликации родительской молекулы ДНК.

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. I

1009

I 1

+

Рис. 25.4. Репликация очень длинной эукариотной молекулы ДНК. Тонкие стрелки показывают расположение точек инициации репликации, в каждой из которых возникают по две репликационные вилки, двигающиеся в противоположных направлениях.

в противоположные стороны. Топологические проблемы репликации, т. е. необходимость шарниров для раскручивания исходного дуплекса, точно такие же и в этом случае, ,как при репликации ДНК Е. coli (рис. 25.4).

У различных животных и даже в ядрах различных клеток одного животного, расстояния между соседними точками инициации варьируют в широких пределах. Например, в оплодотворенных яйцах Drosophila melanogaster, пошедших в стадию быстрого клеточного деления, среднее .расстояние между точками инициации составляет 7000—8000 пар оснований. Следовательно, если две вилки двигаются в противоположных направлениях со скоростью всего 2000 пар оснований на вилку в минуту, то полная репликация длинной хромосомной ДНК дрозофилы может быть завершена за несколько минут.

Интересным примером однонаправленной репликации с использованием одной репликационной вилки является катящееся кольцо. Такой механизм был обнаружен у некоторых вирусов (например, у бактериофага ? Х174). Было показано, что с помощью этого механизма амплифицируются гены рибосомальной РНК

1010 HI. МЕТАБОЛИЗМ

Рис. 25.5. Репликация в одном направлении кольцевой замкнутой двухиитевой молекулы ДНК по механизму катящегося кольца. Процесс начинается с расщепления фосфодиэфирной связи в одной нз нитей. Удлинение З'-конца и вытеснение 5'-конца цепи образует репликациоииую вилку. Кольцевая нить представляет собой бесконечную матрицу. Когда синтезированный участок становится длиннее матрицы и содержит гомологическую последовательность более длины одного генома, то образовавшаяся молекула подвергается расщеплению, вероятно, под действием эндонуклеазы.

(разд. 25.3.6.1) в ооцитах южноафриканской шпорцевой лягушки Xenopus laevis. При этом расщепление единственной фосфодиэфирной связи в ковалентно замкнутой кольцевой ДНК .предоставляет «праймер» для удлинения цепи на З'-конце. Репликация вокруг кольца является, таким образам, вытеснением 5'-фосфатного конца молекулы, который может быть связан с некими структурами, что приводит к образованию единственной репликационной вилки. Вытесненная цепь может затем реплицироваться в направлении от 5'- к З'-концу. В сущности катящееся кольцо дает возможность тандемного расположения повторяющихся последовательностей на матрице с единичной последовательностью (рис. 25.5).

25.3.2. Ферменты репликации ДНК

25.3.2.1. Прокариотические ДНК-полимеразы

Хотя модель Уотсона — Крика (гл. 7) дает общее представление о том, как может идти репликация ДНК, она не дает представления О' химических процессах, протекающих при этом. Исследование механизма синтеза ДНК в экстрактах Е. coli привело к идентификации н последующему выделению фермента — ДНК-полимеразы, которую сейчас обозначают ДНК-полимераза I. Этот

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. I

101 I

матрица

Рис. 25.6. Модель комплекса матрица — праймер, на котором ДНК-полимераза I может катализировать полимеризацию нуклеотидов в направлении от 5' к 3'. Показано образование фосфодиэфириой связи между праймером и входящим dTTP (Lehman J. В. Science, 186, 797. 1974).

фермент катализирует полимеризацию нуклеотидов, специфичность которой определяется матрицей ДНК- Этот фермент послужил прототипом для всех известных в настоящее время зависящих от матрицы полимераз нуклеиновых кислот.

ДНК-полимераза I состоит из одной лолипелтидной цепи (М 110 000). Это металлофермент, содержащий один или два атома Zn+2 иа молекулу фермента. Синтез фосфодиэфириой связи, .катализируемый ДНК-полимеразой I идет по уравнению

Mg2+

(dNMP)„ + dNTP =f=t (dNMP)„+i + P?i

где (dNMP)n обозначает полимер, состоящий из ? дезоксирибо-нуклеотидных остатков, a dNTP — дезокенрибонуклеозидтрифос-фаты. Полимеризация идет исключительно и направлении 5'—>-3' путем присоединения мононуклеотидных блоков из дезоксирибо-нуклеозид-5'-трифосфатов к З'-гидроксиду концевого нуклеотида полинуклеотида — затравки (праймера) (dNMP)„. Реакция заключается в нуклеофнльной атаке З'-гидроксидной группой праймера по ?-фосфору нуклеозидтрифосфата с выделением РРЬ Кроме затравки абсолютно необходима матрица, которая направляет фермент при выборе соответствующих нуклеозидтрифосфатов согласно правилам спаривания нуклеотидов Уотсона — Крика (рис. 25.6). В связи с этим продукт является точной репликой матрицы. Фермент может катализировать и обратную реакцию —фосфоролиз ДНК, хотя быстрый гидролиз PPj неорганической пирофосфатазой сводит ,к минимуму физиологическое значение обратной реакции.

Кроме синтеза и фосфоролиза ДНК-полимераза I может также катализировать гидролиз фосфодиэфириой связи. При соответствующих условиях фермент проявляет две гидролитические активности: одна гидролизует ДНК с З'-конца к 5'-концу (3':—>о'-экзо-нуклеаза), а вторая гидролизует ДНК с 5'-конца к 3'-концу (5'—>-3'-экзонуклеаза). Нативный фермент можно расщепить действием протеиназ (субтилизина или трипсина) с образованием

1012

III. МЕТАБОЛИЗМ

«большого» фрагмента (?? 76 000), который содержит полимераз-ную и 3'—>б'-экзонуклеазную активности, и малого фрагмента (?? 36 000), содержащего только 5'—^З'-экзонуклеазную активность. Таким образом, ДНК-полимераза I содержит ,по крайней мере две различные ферментативные активности в одной полипептидной |цепи.

Полимеразная и 5'—яЗ'-экзонуклеазная активности ДНК-полимеразы I могут работать координирование, катализируя одновременно включение .нуклеотида по З'-концу и удаление нуклеотида с 5'-конца в однонитевом разрыве двунитевой ДНК. Суммарный эффект такого совместного действия 5'—^З'-иолимеразы и 5'—>-3'-экзонуклеазы — продвижение однонитевого разрыва вдоль молекулы ДНК. Такое перемещение разрыва или «трансляция ни-ка» — возможный механизм удаления фотопродуктов, таких, как тиминовые димеры, при репликации повреждений, возникающих при ультрафиолетовом облучении ДНК (разд. 25.3.3). Таким же способом может осуществляться удаление инициирующего фрагмента РНК из вновь синтезированной ДНК (разд. 25.3.2.3).

3'—^5'-Экзонуклеа.зная активность ДНК-полимеразы 1 специфически гидролизует однонитевые ДНК и нарушенные неспаренные концы двунитевой ДНК. Эта активность в самом деле катализирует удаление неопаренных нуклеотидов на З'-конце с образованием полностью спаренного комплекса праймер — матрица, который больше не является субстратом для действия экзонуклеазы. Так, 3'—>5'-экзонуклеаза, действуя координирование с полимера-зой. может удалять неправильно включенные нуклеотиды (не образующие комплементарную пару с основанием матрицы) и таким путем исправлять ошибки, которые были допущены во время полимеризации. Данные, полученные при анализе мутантов фага Т4 по гену, кодирующему индуцируемую фагом ДНК-полимеразу (гл. 28), свидетельствуют в пользу предположения о корректирующей функции 3'—>-5'-экзонуклеазы при репликации ДНК. Единичная мутация такого рода резко повышает частоту мутаций (гл. 7) по всему геному фага Т4. По крайней мере в одном случае было показано, что такой мутаторный эффект ДНК-полимеразы является следствием дефекта 3'—>-5'-экзонуклеазной части му-тантного фермента, что свидетельствует о том, что 3'—>-5'-экзо-нуклеаза играет определенную роль в коррекции ошибок при репликации ДНК-

В условиях, оптимальных для определения активности ДНК-полимеразы I, почти вся ДНК-полимеразная активность могла быть приписана этому ферменту. Так продолжалось до тех пор, пока не был получен жизнеспособный мутант Е. coli с сильно пониженным уровнем ДНК-полимеразы I и были обнаружены и выделены еще две ДНК-полимеразы — II и III. ДНК-полимераза II очен

страница 95
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 2" (8.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»їПохотливые девицы с веб-сервиса http://individualkikazani.info/services/rimming/ чувственно выполнят язычком услугу римминг.
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)