Биологический каталог




Основы биохимии. Том 2

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

ь похожа на ДНК-полимеразу I по катализируемым ими реакциям, но

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. I

1013

не имеет 5'—^'-экзонуклеаэной активности. ДНК-лолимераз.а III гоже похожа на I и содержит как 5'—>-3'-, так и 3'—*-5'-экзонук-леазные активности.

Мутанты Е. coli с термолабильной ДНК-полимеразой III неспособны расти и реплицировать ДНК при 42 °С, но способны делать это при 30 °С, следовательно, этот фермент необходим для репликации ДНК in vivo. У 'некоторых мутантов с поврежденной ДНК-полимеразой I также наблюдается нарушение репликации ДНК in vivo (разд. 25.3.2.3). Функции ДНК-полимеразы II до сих пор не описаны. Некоторые свойства ДНК-полимераз Е. coli сопоставлены в табл. 25.1.

Таблица 25.1 Сопоставление ДНК-полимераз I, II и III Е. coli

I II III

Свойства ?

число молекул иа клетку число оборотов8

Функции6 полимеризация 5' —>- 3'

экзоиуклеазиая активность 3'—к5'

5'-

3'

ПО ООО 400 1 ООО

+

+ +

120 000 100 50

+ +

180 000 10

15 000

+

4-+

а Число нуклеотидов. заполимеризованных в минуту на молекулу фермента при 37 °С ^ + наличие активности. — отсутствие активности. (Корнберг ?., Синтез ДНК. Пер. с англ. — М.: Мир, 1977.)

25.3.2.2. Эукариотические ДНК-полимеразы

Эукариотические клетки, так же как и клетки Е. coli и других прокариот, содержат несколько ДНК-полимераз. Однако в отличие от прокариотических эукариотические не обладают 3'—*5'- и 5'—>-3'-экзонуклеаэными активностями. Преобладающий фермент (от 80 до 90% общего количества) называется а-ДНК-полимеразой (?? 200 000—250 000); количество субъединиц еще не установлено. Вторая полимераза, ?, представлена одной полипептидной цепью (М 45 000). Оба эти фермента локализованы в ядре. Третья ДНК-полимераза (М 106 000) обнаружена в митохондриях, она отличается от а- и ?-фермевтов и, вероятно, катализирует репликацию митохондриальной ДНК.

РНК-содержащие онкогенные вирусы (саркомы Роуса, птичьего миелобластоза, лейкемии Раушера, гл. 28) содержат в составе

Ю14

III. МЕТАБОЛИЗМ

вириона уникальную РНК-зависимую ДНК-полимеразу, которую часто называют обратной транскриптазой. Этот фермент может катализировать синтез ДНК-копии вирусной РНК, которая далее может интегрировать (встраиваться) в хозяйский геном. В таком провирусном состоянии вирусный геном .может эиспрессироватьея, что приводит либо к размножению вируса, либо к образованию опухоли.

Обратная транскриптаза, выделенная из вируса птичьего миелобластоза, была изучена наиболее подробно среди представителей этого класса ферментов. Она содержит два атома Zn2+ на молекулу фермента (?1 170 000), который состоит из двух субъедиииц ? 105 000 и 65 000 соответственно. Ферментативная активность сосредоточена в гмалой субъединице, функции большой субъединицы неизвестны.

Вирусная РНК-зависимая ДНК-полимераза наиболее сильно отличается от клеточных полимераз своей способностью попользовать в качестве комплекса праймер—матрица выделенную из вириона РНК- Эта РНК представляет собой 70S-(комплекс, содержащий четыре 358-компонента и от 12 до 40 фрагментов РНК с константой седиментации 4S. Одним из них является триптофановая тРНК (гл. 26), которая служит специфическим праймером в этой реакции. Обратная транскриптаза обладает также рибонуклеазной активностью, называемой РНазой Н, которая специфически расщепляет РНК в РНК—ДНК-гибриде, синтезирующемся при действии этой полимеразы. РНК-зависимая ДНК-полимераза обнаружена также в экстрактах из тканей животных, у которых не показано наличие РНК-еодержащих онкогенных вирусов. Эти ферменты можно отличить от ?-, ?- и митохондриальной ДНК-полимераз по их способности использовать синтетические полирибонуклеотиды в качестве матрицы; клеточные ДНК-полимеразы отличаются от обратных транскриптаз также тем, что они не могут использовать природные РНК в качестве матриц и не обладают ассоциированной активностью РНазы Н.

25.3.2.3. Мультиферментные компоненты репликации ДНК

Полимеризация нуклеотидов всеми известными ДНК-полимера-замн идет только в направлении от 5' к 3' и абсолютно нуждается в праймере со свободной З'-гидроксидной концевой группой, к которому и присоединяются полимеризуемые нуклеотиды. Для того чтобы полностью объяснить полуконсервативную репликацию молекулы ДНК, необходимо ответить на следующие вопросы: 1) Каким образом одновременно синтезируются две нити двухнитевого дуплекса ДНК, имеющие противоположную химическую полярность (3'—н5' для одной цепи и 5'—>3' для другой)? 2) С помощью какого механизма инициируется новая цепь ДНК? Хотя

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. 1

1015

эти проблемы еще не решены полностью, ??? о них уже имеется значительная информация.

Заключения о сложности процесса .репликации были получены при генетическом анализе репликации ДНК у Е. coli. Эти исследования привели к обнаружению класса условно-летальных мутантов, у которых нормальная репликация ДНК и, следовательно, рост возможны при 30 °С и невозможны при 42 °С. Основываясь на данных генетического .картирования (см. выше), эти темпера-турочувствительные мутанты .были отнесены к шести отдельным локусам хромосомы Е. coli, обозначенным dnah, dnaB, dnaC, dnaE, dnaG и dnaZ. Продукт гена dnaE был идентифицирован как ДНК-полимераза III. Хотя продукты остальных .генов неизвестны, предполагается, что продукты генов dnak и dnaC участвуют в инициации репликации хромосом, а остальных генов — в удлинении цепи.

Другие белки, кроме тех, которые определяются dna-генами, также, вероятно, необходимы для репликации ДНК- Одним из них является ДНК-связывающий 'белок, который прочно и специфично связывается с однонитевой ДНК, ио слабо или вовсе не связывается с двунитевой ДНК. Так как временное плавление участков дву-спиральной ДНК происходит и при физиологической температуре, особенно на участках, обогащенных тиминсм и аденином (гл. 7), то этот белок может связываться с такими временно однонитевы-ми участками в составе дуплекса, смещая положение равновесия между одно- и двуслиральным состояниями. В результате этого может произойти локальное разделение двух нитей при температуре значительно ниже температуры плавления. Можно предполагать, что этот белок может облегчить раскручивание двойной спирали впереди репликационной вилки (см., например, рис. 25.2). Кроме того, обнаружены ферменты, катализирующие раскручивание двуспиральных молекул ДНК, сопряженное с гидролизом АТР до ADP и Pi. ДНК-гираза Е. coli (разд. 25.3.1) специфически ингибируется антибиотикам новобиоцином, который, как известно, ингибирует репликацию ДНК. Таким образом, функционирование этого фермента играет важную роль при репликации хромосом организма.

Исследование клеток, к которым во время роста на очень короткое время (от 5 до 30 с) добавлен радиоактивный тимидин, показало, что вновь синтезированная ДНК. Е. coli находится в виде коротких фрагментов длиной от 1000 до 2000 нуклеотидов. Эти короткие цепи ДНК затем включаются в основную реплицирующуюся молекулу ДНК с помощью соединяющего фермента — ДНК-лигазы. У мутантов, дефектных по ДНК-лигазе или ДНК-по-лимеразе I, эти фрагменты могут составлять основную часть вновь реплицированной ДНК. Роль ДНК-полимеразы I в этом процессе обсуждается ниже. Так как короткие вновь возникающие фрагмен-

1016

III. МЕТАБОЛИЗМ

Рис. 25.7. Прерывистая репликация ДНК. Следует подчеркнуть, что так как репликация должна идти в направлении от 5' к 3' для обеих нитей, то полимеризация не может идти одновременно на обеих нитях. В результате этого в районе репли-кационной вилки должны существовать временные однонитевые участки.

ты ДНК синтезируются .в направлении 5'—»-3' (в направлении 3'—»-5' относительно матрицы) (рис. 25.7), прерывистый способ репликации может объяснить одновременную репликацию в направлении от 5' к 3' обеих нитей дуплекса ДНК- Следует отметить, что, согласно этой модели, только запаздывающая нить, которая формально реплицируется в направлении от 3' к 5', должна реплицироваться прерывисто; ведущая нить .может реплицироваться непрерывно.

Синтез фосфодиэфирной связи, катализируемый ДНК-лигазой, идет по механизму, отличающемуся от того, который характерен для ДНК-полимеразы. Синтез происходит между соседними 5'-фосфатной и З'-гидроксидной группами в двухспиральной ДНК, сопряженно с расщеплением пирофосфатной связи в NAD4-(Е. coli и другие прокариоты) или у АТР (эукариоты) в три последовательные стадии: 1) перенос аденильной группы от NAD или АТР на ?-аминогруппу лизинового остатка фермента с образованием ковалентного промежуточного фермент-аденилатного комплекса с фосфоамидной связью, что сопровождается выделением никотннамидмононуклеотида или РРь 2) активация 5'-фосфо-рильного конца ДНК путем переноса аденильной группы с фермента и образование пирофосфатного производного — ДНК-адени-лата; 3) образование фосфодиэфирной авязи путем атаки З'-гид-роксидного конца ДНК по активированной 5'-фосфатной группе с выделением AMP ,(рис. 25.8).

Хотя прерывистый способ репликации ДНК может объяснить одновременное считывание в .направлении 5'—*·3' обеих нитей дуплекса ДНК, он оставляет .без ответа вопрос о механизме инициации. Соображение о том, как это может происходить, появилось при изучении репликации мелкого бактериального вируса М13. Этот и родственные бактериофаги содержат одну кольцевую 'молекулу однонитевой ДНК, состоящую из примерно 5500 нуклеотидов. На начальной фазе репликации эта ДНК превращается в замкнутую кольцевую двунитевую ,молекулу (гл. 28).

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. I

(NAD*)

? — (Lye)— ??«+ О О

+ A-R-qi=P-Q- ?-О-R— ?

E-(Lye)-NH2 °~ °~

или

О О

II II II

A-R-O-P-O-jP-?-?-?

?4—*? l_ о- о- о

(????

? о E-(Lys)-N+-P-0-? О-

R—А +

? О

l+ II

E-(Lye)-N -Р-О-I I

? сг

¦R-A +

Mill

-гтт

H0V0^

I I I I I

TT

+ E-(Lys)-NH2

?

f N О О"

? - R -A

E-(Lvs)-NH3+

X

fs\_ E-(Lye)-NH3+ O-

rrm—--гтт -U ? ? ? ? ? Hi + н+ + o_

I

o~- ? = о ?

о

"ч /- I „Р R ' I

О- O-R-A

Рис. 25.8. Механизм ДНК-лигазной реакции. ??? — никотинамидмононуклеотид (Kornberg ?., Science, 1

страница 96
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 2" (8.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)