гклюкозилированный оксиметилцитозин служит для защиты ДНК этих фагов от расщепления их эндонуклеазами, которые быстро и полностью расщепляют хозяйскую ДНК, продукты расщепления которой используются для синтеза фаговой ДНК.

Другой и более общей модификацией ДНК является метилирование N6-aMHHorpyininbi аденозина (и, гораздо реже, С-5 цитозина) в составе ДНК. Это происходит путем переноса метильной группы с S-аденозилметионина на адениновый или цитозиновый остаток в специфических последовательностях ДНК, что катализируется соответствующей трансметилазой (разд. 21.4.2.10). Метилирование этих последовательностей делает ДНК иммунной по отношению к действию соответствующих рестрикционных нуклеаз, которые производят расщепление обеих нитей ДНК, не имеющей такой модификации. Таким образом, система модификации и рестрикции способна разрушать чужую ДНК, которая может попасть в клетку, но защищает собственную ДНК, сообщая, таким образом, клетке иммунность по отношению к чужой, например вирусной, нуклеиновой кислоте.

Рестрикционные эндонуклеазы были обнаружены ??· многих видах бактерий и некоторые из них получены в гомогенном состоянии. Они образуют два класса: тип I, которые нуждаются в Mg2+,

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. I

1023

АТР и S-адено-зинметионине для расщепления фосфодиэфириой связи, и тип II, которые нуждаются только в Mg2+. Для ферментов первого типа неизвестно, какую роль играют АТР и S-адено-зилметионин, и не идентифицированы продукты расщепления ДНК. Гораздо больше известно о рестрикционных ферментах типа II. Более чем для 50 ферментов этого типа определена последовательность модифицируемых и расщепляемых участков ДНК; некоторые примеры приведены в табл. 25.3. Важное обобщение,

Таблица 25.3

Участки узнавания некоторыми ферментами рестрикции3

Фермент

Последовательность иа рестриктируемом участке

EcoRl

Hindi!

Bgm

Haell

\

5'-G-A*-A-T-T-C--C-T-T-A-A*-G-5'

\ t

5'-G-T-Py-Pu-A*-C

-C-A*-Pu-Py-T-G-5'

i t

5'-A*-G-A-T-C-T-

-T-C-T-A-G-A*-5' t \

5'-Pu-G-C-G-C*-Py--Py-C*-G-C-G-Pu-5' t

Основания, модифицированные специфическими метилазами, отмечены звездочками. А* обозначает 1Чв-метиладеннн, а С* — 5-метилцитозин. Система номенклатуры рестрикционных ферментов приведена в работе: Smith ?., Nutans D., J. Mol. Biol.. 81 491(1873). Так, ?coKT — это фермент из ?. coli. обладающей фактором резистентности I: Hindll — фермент Hemophilus Influenzae R^; В gill — фермент Bacillus globiggi; Haell — фермент Hemophilus aegyptius. Стрелки показывают точки расщепления цепи.

сделанное при анализе полученных результатов, заключается в том, что участки расщепления симметричны. Они обладают осью симметрии второго порядка, которая перпендикулярна оси спирали ДНК- В ряде случаев места расщепления на обеих цепях «е совпадают и образующиеся продукты обладают перекрывающимися З'гидроксидными и 5'-фосфатными концами. Так как по крайней мере один из ферментов, ЯсоРчЬвндонуклеаза, состоит из двух одинаковых субъединиц, симметрия второго порядка при расщеплении может отражать симметричное расположение оубъединиц.

Благодаря способности расщеплять немодифицированную ДНК с высокой специфичностью рестрикционные нуклеазы стали ценными реагентами для определения первичной структуры ДНК. Они

J024

??. МЕТАБОЛИЗМ

используются также для генетического картирования вирусных хромосом (гл. 28). Использование рестрикциоиных нуклеаз для конструирования и клонирования гибридных молекул ДНК описано в разд. 25.4.1.

В дополнение к высокоспецифичным системам модификации и .рестрикции, описанным выше, имеются трансметилазы, которые ^катализируют метилирование S-аденозилметионином адениновых -и цитозиновых оснований ДНК с образованием 6-метиламинопури--»на и 5-метилцитозина в гораздо- большем количестве, чем при действии системы модификации — рестрикции; эти две системы относительно незавиоимы, и их функции неизвестны.

25.3.5. Структура хромосом эукариот

В отличие от прокариот эукариоты имеют больше чем одну .хромосому. Однако целый ряд данных свидетельствует о том, что каждая хромосома содержит единственную молекулу ДНК- Авто-радиографический анализ хромосом растений и млекопитающих, меченных третированным тимидином и затем претерпевших деление на протяжении нескольких поколений, .показывает, что меченая молекула сохраняется в виде целой цепи. Вискозиметрические данные свидетельствуют о том, что размер наибольших молекул ДНК из D. melanogaster соизмерим с количеством ДНК в самой большой хромосоме. Анализ скорости седиментации и электронная микроскопия хромосом дрожжей также обнаруживают интактные молекулы ДНК такого размера, которые и ожидались для хромосом этих организмов, если принять, что в состав каждой хромосомы входит единственная молекула ДНК- Следовательно, молекула ДНК длиной 1 см должна быть упакована В хромосому длиной 1 нм. Такая тесная упаковка обеспечивается, в частности, благодаря ассоциации с гистонами, что приводит к образованию хроматина (гл. 7). Были обнаружены и другие, «роме гистонов, белки, ассоциированные с ДНК в хромосомах. Эти «егиетоновые хромосомные белки исключительно разнообразны по свойствам, и нет сомнений, что они играют важную структурную, ферментативную и регуляторную роль в хроматиновом комплексе.

Анализ очищенного хроматина свидетельствует о том, что он содержит равные весовые количества гистонов и ДНК и равное количество основных аминокислот и фосфатных групп ДНК. Таким образом, ДНК-гистоновое взаимодействие, скорее всего, стабилизируется за счет взаимодействия зарядов.

В хроматине обнаружено пять типов гистонов, обозначенных HI, Н2А. Н2В, НЗ и Н4 (гл. 7). Они присутствуют примерно ? эквимолярпом соотношении, за исключением HI, которого содержится в два раза меньше, чем каждого из остальных. Кроме взаимодействия с ДНК гистоны могут ассоциировать друг с другом. Так, гистоны НЗ и Н4 могут существовать в растворе в виде тетра-

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. I

1025

мера типа (НЗ)2(Н4)2, а гистоны Н2А и Н2В могут давать полимер типа (Н2А—Н2В)„.

Рентгеноструктурный анализ ядер и выделенного хроматина показывает, что гистоны и ДНК расположены ,в виде структуры с периодом повторения 110 А. Если хроматиновые нити расщепить с помощью микрококковой нуклеазы (гл. 7), образуется серия дискретных фрагментов, которые представляют собой наборы повторяющихся блоков размеров примерно 200 пар оснований. Под электронным микроскопом хроматин представляет собой цепь бусин на нитке. Эти .бусины, называемые ню-телами или нуклеосома-ми, имеют диаметр примерно ПО А, ? 200 000 и содержат по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4; размер нуклеосомы соответствует повторяющемуся .фрагменту ДНК длиной примерно в 200 пар оснований. Модель структуры хроматина, построенная на основе этих и аналогичных исследований, состоит из повторяющихся единиц, построенных из основных частиц, содержащих 140 пар оснований, разделенных блоками по 40 пар оснований. Гистоны Н2А, Н2В, .ИЗ и Н4 входят в состав этих частиц, а ,ги-стон HI заключается в разделяющих секторах. Таким .способом фрагменты ДНК, содержащие примерно 200 пар оснований и имеющие длины 700 А, могут быть сконденсированы в структуру диаметром 110 А.

Хотя детали этих структур неизвестны, но электронно-микроскопический анализ и исследование малоуглового рассеивания нейтронов нуклеосомами .свидетельствуют о том, что ДНК расположена на поверхности этих частиц с радиусом вращения 50 А, а гистоны —внутри с радиусом вращения 30 А.

Очевидно, что гистоны играют важную роль в упаковке ДНК у эукариотных хромосом и могут служить .для регуляции генетической активности. Так, с помощью габридизационного теста (разд. 25.3.6) было показано, что мРНК, синтезированная in vitro РНК-полимеразой на выделенном хроматине в качестве матрицы, представляет только небольшую часть генов, существующих в геноме. Кроме того, РНК, синтезированная в этих условиях, почти идентична РНК, выделенной из клетки. Ограниченная способность хроматина к транскрипции является следствием ассоциации ДНК с гистонами, так как удаление .белка любым способом приводит к увеличению матричной активности.

Хотя аминокислотная последовательность гистонов необычайно консервативна, гистоны могут быть сильно модифицированы. Среди модифицированных аминокислот были обнаружены моно-, ди-и три-Е-М-метиллизины, ?-?-метилзргинин, 3-метилгистиди'Нг ?-?-ацетилсерин, ?-?-ацетиллизин, О-фосфосерин, О-фосфотрео-нин, ?-фосфолизин и Ы3-фосфогистидин. Модификация гистонов'. идет по специфическим участкам каждого гистона и происходит только в определенные моменты клеточного цикла. Функции спе-

1026

111. МЕТАБОЛИЗМ

Рис. 25.12. Структура ADP-рибозы (Nishisaka Y., Veda К., Yoshichara ?-, Yama-mura ?., Takeda ?., Hayashi ?., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 34, 781,

1969).

цифического характера модификации неизвестны; однако это, вероятно, влияет на взаимодействие гистонов с ДНК и может таким образом модулировать активность генов.

Кроме метилирования и фосфорилирования гистоны могут подвергаться полиаденозиндифосфатрибозилированию (поли-ADP-pH-бознлнрование). Соответствующий фермент, который находится в ассоциированном с хроматином состоянии, катализирует перенос ADP-рибозного остатка с NAD на гистон HI и, возможно, другие хрО'Матиновые белки с образованием полимера длиной до 50 остатков.

? NAD -f- гистон < > ? никотшамид -f- (АОР-рибоза)„-гистон

Полимер построен из повторяющихся остатков ADP-рибозы, в которых межнуклеотидная связь образована между С-1 одного и С-2 соседних рибозных остатков. Возможная структура поли-ADP-рибозы дана на рис. 25.12.

25.3.6. Повторяющиеся последовательности в ДНК эукариот

У прокариот практически все последовательности нуклеотидов содержатся в хромосоме в одной копии на гаплоидный геном, т. е. они не повторяются. В противоположность этому определенные .последовательности у эукариот могут быть повторены многократно. Повторяющаяся часть генома может изменяться при переходе от одного организма к другому; однако эта часть обычно значительна и может сос