Биологический каталог




Основы биохимии. Том 2

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

тавлять более чем половину генома. Принципиальное различие между прокариотическими и эукариотическими геномами можно легко обнаружить, изучая кинетику реассоциации ДНК из двух источников (рис. 7.6). Если ДНК прокариота фраг-

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. I 1027

Рис. 25.13. Визуализация гетеродуплексной структуры, образованной одной цепью ДНК фага дикого типа и комплементарной цепью фага, имеющего делецию. а — электронная микрофотография; б — схема гетеродуплексной молекулы, показывающая делеционную петлю; в — схема гетеродуплексной молекулы (Courtesy of Dr.

Davis).

ментировать до небольших фрагментов длиной .менее 500 пар оснований, денатурировать их и образовавшиеся однонитевые фрагменты реассоциировать ,с образованием двунитевых молекул, то кинетика реассоциации .подчиняется единому уравнению реакции второго порядка, свидетельствуя о том, что практически все последовательности ггрокариотного генома представлены единственньши копиями.

Пример точности реассоциации дает изучение реакции между нитью ДНК фага ? дикого типа и комплементарной нитью из мутанта, у .которого делетирован фрагмент ДНК- Гетеродуплекс, образуемый (этими .нитями, должен иметь однонитевую петлю, содержащую тот участок ДНК фага дикого типа, который отсутствует в делеционном мутанте. Такой гетеродуллексмый участок можно' легко обнаружить иод электронным микроскопом;(рис. 25.13). Раз-

1028

III. МЕТАБОЛИЗМ

мер делеции и ее положение можно определить, измерив относительные контурные длины. Действительно, варианты такого гете-родуплексного картирования доведены до совершенства — можно картировать даже мутации, обусловленные изменением одиночной пары оснований.

Кинетика реассоциации эукариотных ДНК более сложна, так как эта ДНК содержит повторяющиеся и неповторяющиеся последовательности (рис. 25.14).

Многократнаповторяющиеся последовательности, которые хорошо видны на графике реассоциации, 'можно физически отделить от остальной ДНК с помощью изопикнического центрифугирования в градиенте СзС1 (гл. 7). Этого легче всего можно достигнуть, расщепив ДНК с помощью гидродинамического сдвига на двуни-тевые фрагменты длиной ib 10 000—60 000 пар оснований перед центрифугированием. В этих условиях ДНК распределяется в основной полосе и в наборе меньших полос, называемых сателлит-ными полосами (рис. 25.15).

У человека обнаружены четыре сателлитные ДНК, которые составляют 6% хромосомной ДНК, или 174 000 000 пар оснований на геном. Преобладающие сателлитные ДНК обычно имеют очень простую многократно повторяющуюся последовательность. Например, сателлитная ДНК с плавучей плотностью 1,672 г/см3

о

C0t, моль-с л-1

Рис. 25.14. Кинетика реассоциации ДНК человека. Реассоциацию измеряют по степени связывания с оксиапатитом; однонитевая ДНК прочно связывается с ок-сиапатитом в отличие от двухнитевой ДНК, которая не связывается. Кривые отражают наличие трех типов последовательностей: высокоповторяющиеся, умерен-ноповторяющиеся и неповторяющиеся (Arrighi F. ?., Saunders G. F., p. 113, in R. F. Rfeifer ed., «Modern Aspects of Cytogenetics: Heterochromatin in Man*. F. K. Shattauer Verlag, Stuttgart, 1972).

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. I

1029

1,701

Плавучая плотность, г/см* —

Рис. 25.15. Отделение сателлитных ДНК от основной массы ДНК Drosophila те-lanogaster центрифугированием в градиенте плотности CsCI. Пик 1,701—основная полоса ДНК; пики 1,672 и 1,688 —две сателлитные ДНК (Peacock А. /., Brutlag D., Goldring ?., Appels R., Hinton C. W., Lindsley D. I., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 38, 405, 1973).

(рис. 25.15), имеет приведенную ниже последовательность, повторенную 12Х106 раз.

-А С А А А С Т. -Т G ? ? ? G A-

Функция сателлитных ДНК до сих пор неизвестна. Они обнаруживаются обычно в центромерных участках хромосом и могут участвовать ib спаривании и сегрегации хромосом.

У многих эукариот большая часть умеренноповторяющихся последовательностей перемежается неповторяющимися последовательностями, ио иногда они расположены тандемно. Так, в хромосоме X. laevls короткие повторяющиеся последовательности длиной 300 пар оснований перемежаются неповторяющимися последовательностями длиной примерно 1000 пар оснований. Функция перемежающих умеренноповторяющихся последовательностей неизвестна, но предполагается, что они играют некоторую регулятор-ную роль в выражении генов (см. ниже).

Хотя большая часть умеренноповторяющихся последовательностей перемежается неповторяющимися последовательностями, некоторые умеренноповторяющиеся последовательности расположены тандемно. Примеры такого тандемного расположения описаны в следующих разделах.

1030

111. МЕТАБОЛИЗМ

25.3.6.1. Гены 18S и 28S рибосомных РНК

Повторяющейся единицей в этом расположении является участок, который при 'транскрипции дает единую цепь РНК (тран-окрипт). Транскрипт подвергается «созреванию», т. е. расщеплению специфическими нуклеазами с образованием 18S и 28S рибосомных РНК, а также спейсерный участок ДНК, который не транскрибируется и функции его неизвестны.

транскрибируемый участок спейсер

повтори юш,а яс я; еЭиница.

транскрибируемый

участок спейсер

повторяющаяся еЭиница

Эукариотный геном содержит обычно несколько сотен повторяющихся единиц; они локализованы в области хромосомы, которая образует ядрышко и называется ядрышковым организатором.

25.3.6.2. Гены 5S рибосомной РНК

5S РНК транскрибируется не с того гена, который кодирует 18S и 28S рибосомные РНК. В гаплоидном геноме X. laevis содержится примерно 2,5· 104 копий этого маленького гена. Хотя эти гены расположены во многих (местах различных хромосом, каждый участок содержат много копий, расположенных тандемно и разделенных спейсером, как и гены 18S и 28S рибосомных РНК.

25.3.6.3. Гены транспортных РНК

Каждый ген транспортной РНК у X. laevis расположен тандемно и также перемежается спейсером.

25.3.6.4. Геиы для синтеза гистонов

В ядрах некоторых видов морских ежей каждый гистоновый ген .повторен почти 1000 раз. У этих животных предполагается, что по 'крайней мере четыре гистоновых гена тесно сцеплены друг с другом и такая группа вместе со спейсерной ДНК, положение которой относительно четырех генов неизвестно, образует тандемно повторяющуюся единицу.

25.3.7. Значение умеренноповторяющихся последовательностей

Анализ прокариотных хромосом показывает, что почти вся ДНК в хромосоме служит для кодирования белков. Для эукариот

25. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА. I

1031

это не так, у них только неповторяющиеся и немногие умеренно-повторяющиеся последовательности транскрибируются и транслируются. Правдоподобной, но еще непроверенной .моделью для объяснения роли умеренноповторяющихся последовательностей, в частности тех, которые расположены между неповторяющимися последовательностями, является предположение, что они представляют собой участки для связывания регуляторных молекул (РНК или белка). Основанием для построения такой модели послужило то, что у различных типов клеток в сложном организме должны активироваться различные комбинации генов и определенный ген может работать в различных комбинациях. Если каждая комбинация контролируется одной или более регуляторных молекул, то соответствующий ген должен быть способен отвечать более чем на один регулятор. Следовательно, кодирующие гены должны быть ассоциированы, например, с набором рецепторных участков, что иллюстрируется следующей диаграммой:

поолейоватепьностъ умеренноповторяющзяся повторяющаяся

г2 гз Г4 Г5 Г6 к.оЭириклца?

рецепторные участки область

25.4. Манипуляции генетическими элементами

25.4.1. Выделение генов клонированием рекомбинантных молекул ДНК, сконструированных in vitro

Фрагменты ДНК из бактериальной хромосомы могут быть включены в ДНК бактериофага путем генетической рекомбинации in vivo (разд. 25.9.1). Таким образом может быть получена гомогенная популяция ДНК для изучения .бактериальных генов. Гомогенность является следствием того, что все молекулы в популяции являются прямыми потомками единственной молекулы ДНК, т. е. ДНК подверглась клонированию. Недавно стало возможным включать in vitro фрагменты ДНК любого происхождения в ДНК бактериофагов или различных бактериальных плазмид. Последние являются небольшими кольцевыми ДНК (5000—10 000 пар оснований), которые могут реплицироваться автономно в бактериальной клетке. Образующуюся при этом гибридную молекулу ДНК можно -затем клонировать in vivo. Новая методология позволяет выделить индивидуальные фрагменты ДНК (гены) из любого источника в больших количествах и в индивидуальном состоянии.

Было разработано несколько методов для конструирования таких гибридных молекул ДНК. Один из них показан на рис. 25.16,

III. МЕТАБОЛИЗМ

-GAftTTC -CTTAAG

?-

расщепление Eco RI-энЭонуклеазой

«· — G AATTC -

ч--CTTAA G ¦

плвэмиВная f ( ДНК

•G

• CTTAA

W____

>._____

G

CTTAA

AATTC

AATTC G-

поЭлежа , щая клонированию ДНК

О

отжиг и сшивание ДНК-лигазой

,----QAATTC--.

___QAATTC _)) ДНК

---UTTAAQ-'

Рис. 25.16. Конструирование in vitro гибридной молекулы ДНК. Плазмидную ДНК, содержащую только один участок расщепления рестриктазой, и ДНК. подлежащую клонированию, подвергают действию эндонуклеазы ?coRI; расщепленные ДНК отжигают и сшивают лигазой, в результате чего образуется гибридная

молекула ДНК.

где саморазмножающейся молекулой ДНК (вектором) является плазмнда, которая придает устойчивость к антибиотику тетрациклину и благодаря этому позволяет проводить фенотнпическую селекцию клеток, содержащих эту плазмиду. Кольцевую ДНК плазмиды сначала расщепляют в одном месте с помощью ?соРЛ-эндо-нуклеазы (табл. 25.3), чтобы образовать концы, которые идентичны и комплементарны:

{ 3' S'

—GAATTC— —G ААТТС-

-> +

—CTTAAG— —CTTAA G-

ДНК, которая должна быть включена в плазмиду, тоже подвергается расщеплению для образования набора аналогичным образом терминированных фрагментов. Эти фрагменты затем отжигают в присутствии расщепленной плазмиды, причем они соединяются за счет комплем

страница 99
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 2" (8.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)