афилококка и стрептококков, в воде — кишечной палочки, БГКП, энтерококка, в почве — кишечной палочки, БГКП, клостридии перфрингенс, в продуктах питания — кишечной палочки, БГКП, энтерококка, золотистого стафилококка, протея. На основании количественного выявления санитарно-показательных микроорганизмов вычисляются коли-титр, перфрингенс-титр, титр энтерококка и т.д. Так, например, коли-титр или титр энтерококка воды — это наименьшее количество воды, в котором определяется кишечная палочка или энтерококк. Показателем загрязненности воды является также коли-индекс — число кишечных палочек в 1 л воды.

Часто вместо коли-титра определяются титр БГКП, к которым относят все грамотрицательные палочки, сбраживающие с образованием кислоты и газа лактозу или глюкозу при температуре 37±0,5 °С в течение 24—48 ч и не обладающие оксидазной активностью. Наиболее часто этот показатель применяют как индикатор фекального загрязнения воды. При бактериальном загрязнении воды свыше допустимых норм следует провести дополнительное исследование на наличие бактерий — показателей свежего фекального загрязнения. К таким бактериям относят кишечную палочку, способную расщеплять лактозу до кислоты и газа при температуре 43—44 °С в присутствии ингибиторов роста (борная кислота) и не растущую на цитратной среде. О свежем фекальном загрязнении свидетельствует также выявление энтерококка. На старое фекальное загрязнение указывают отсутствие БГКП и наличие определенного количества клостридии перфрингенс, т. е. наиболее устойчивых спорообразующих бактерий.

Кроме определения патогенных, условно-патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов, в практике санитарно-микробиологических исследований используется определение микробного числа, т. е. общего количества микроорганизмов в определенном объеме или определенной массе исследуемого материала (вода, почва, продукты питания, лекарственная форма и др.).

Санитарный надзор за состоянием объектов общественного питания, аптек, лечебных и детских учреждений осуществляется исследованием смывов с рук персонала, посуды, поверхности столов, оборудования и др. Смыв высевают на различные питательные среды для определения микробной обсемененности, наличия БГКП, патогенных энтеробактерий, золотистого стафилококка, грибов рода Candida и энтеровирусов.

Глава 5 ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Генетика микроорганизмов как учение о наследственности и изменчивости имеет характерные особенности, соответствующие их строению и биологии. Наиболее изучена генетика бактерий, характерными чертами которых являются малые размеры и большая скорость размножения бактериальной клетки, что позволяет проследить генетические изменения в течение небольшого промежутка времени на большом числе популяций. Бактериальная клетка имеет одинарный набор генов (нет аллелей). Хромосома бактерий является полинуклеотидом (две полинуклеотидные цепочки ДНК) длиной 1000 мкм и мол. массой около 1,5—2* 109Д. Она суперспирализована и замкнута в кольцо: содержит от 3000 до 5000 генов. Аналогично хромосоме в цитоплазме бактерий располагаются ковалентно замкнутые кольца ДНК, называемые плазмидами (внехромосомные факторы наследственности). Масса плазмид значительно меньше массы хромосом. Хромосома и плазмида способны к автономному самокопированию — репликации, поэтому их называют репликонами. Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов — почти синоним понятия «генотип».

Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень возможных для данной клетки фе-нотипических изменений определяются набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.

В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.

Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивость обусловлена влиянием внутри- и внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, данные изменения исчезают.

Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, — мутационная изменчивость. Основу мутации составляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, полная или частичная их утрата, т. е. происходит структурная перестройка генов, проявляющаяся фенотипически в виде измененного признака.

Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной изменчивостью.

5.1. Рекомбинации у бактерий

Рекомбинация (ре + лат. combinatio — соединение) — возникновение новых последовательностей ДНК в результате разрывов и последующих восстановлений ее молекул. В итоге таких изменений ДНК бактерий появляются так называемые рекомбинан-тные штаммы, или рекомбинанты. Процесс рекомбинации у бактерий имеет некоторые отличия, связанные с особенностями их генетического аппарата, форм генетического обмена. Именно на микробных объектах были открыты формы переноса генетического материала — трансформация, трансдукция, конъюгация, неизвестные классической генетике, с помощью которых изучаются молекулярные механизмы генетических рекомбинаций.

В процессе генетического переноса участвуют бактерия-реципиент и бактерия-донор. Степень участия их неравномерна: в ре-ципиентную клетку попадает лишь фрагмент экзогенной ДНК бактерии-донора, который взаимодействует с цельной хромосомой реципиента, в результате чего происходит частичное перераспределение (рекомбинация) генетического материала с образованием рекомбинанта. Все этапы рекомбинации у бактерий обеспечиваются соответствующими ферментами: рестриктазами, лигазами и др. У бактерий различают три типа рекомбинаций: общую, «незаконную» и сайт-специфическую. Общая, или гомологичная, классическая, рекомбинация происходит, если в структуре взаимодействующей ДНК имеются гомологичные участки (от греч. homologia — соответствие). Так называемая «незаконная» рекомбинация для своего осуществления не требует значительной гомологии ДНК взаимодействующих структур.

Образование Трансдукция

трансдуцирующего фага

В «незаконной» рекомбинации участвуют небольшие фрагменты ДНК, которые способны перемещаться, мигрировать по реп-ликону (плазмиде, хромосоме) или между репликонами. Эти фрагменты ДНК называют подвижными генетическими элементами: IS-элементы (от англ. insertion sequences — вставочные последовательности) и транспозоны. IS-элементы — специфические мигрирующие фрагменты ДНК, содержащие гены, необходимые для интеграции с негомологичными участками репликонов. Транспозоны — более сложные генетические структуры ДНК, которые содержат в своем составе IS-элементы и дополнительные гены (например, гены лекарственной устойчивости и др). Подвижные генетические элементы вызывают повреждение или инактивацию генов, слияние репликонов, распространение генов среди бактерий.

Общая рекомбинация наиболее эффективна при внутривидовом генетическом обмене, «незаконная» рекомбинация играет важную роль не только в пределах отдельных видов, но и между бактериями различных видов и родов.

Третьей разновидностью рекомбинации является так называемая сайт-специфическая рекомбинация (от англ. seit — местоположение, участок), для осуществления которой необходимы строго определенные последовательности ДНК и специальные ферменты. Сайт-специфическая рекомбинация происходит в менее протяженных участках генома (в пределах 10—20 пар нук-леотидов), например при включении профага в строго ограниченные участки (сайты) хромосомы.

Наиболее изучены три типа передачи ДНК, отличающиеся друг от друга способом ее транспортировки: трансформация, трансдукция, конъюгация (рис. 5.1).

5.1.1. Трансформация

Трансформация (от лат. transformatio — превращение) заключается в том, что ДНК, выделенная из бактерий в свободной растворимой форме, передается бактерии-реципиенту. При трансформации рекомбинация происходит, если ДНК бактерий родственны друг другу. В этом случае возможен обмен гомологичных участков собственной и проникшей извне ДНК. Впервые явление трансформации описал Ф. Гриффите (1928). Он вводил мышам живой невирулентный бескапсульный R-штамм пневмококка и одновременно убитый вирулентный капсульный S-штамм пневмококка. Из крови погибших мышей был выделен вирулентный пневмококк, имеющий капсулу убитого S-штамма пневмококка. Таким образом, убитый S-штамм пневмококка передал наследственную способность капсулообразования R-штамму пневмококка. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти (1944) доказали, что трансформирующим агентом в этом случае является ДНК. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: капсулообразование, устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов.

Изучение бактериальной трансформации позволило установить роль ДНК как материального субстрата наследственности. При изучении генетической трансформации у бактерий были разработаны методы экстракции и очистки ДНК, биохимические и биофизические методы ее анализа.

5.1.2. ТрЬнсдукция

Трансдукция (от лат. transductio — перенос, перемещение) — передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмента ДНК донора, и специфическую — перенос определенного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента. Неспецифическая трансдукция обусловлена включением ДНК донора в головку фага дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая трансдукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора. Фаговая ДНК, несущая фрагменты хромосомы клетки-донора, включается в строго определенные участки хромосомы клетки-реципиента.