|
|
Ферменты рестрикции и их применениеная цепь расщеплялась быстрее, чем немодифицированная. Защита ДНК от действия рестриктаз может происходить вследствии ее модификации другими метилазами, узнаваемые последовательности которых полностью или частично перекрываются с субстратным участком исследуемых рестриктаз. Инте- 47 pec представляют те случаи, когда такое метилирование затрагивает другие нуклеотиды, немодифицируемые канонической метилазой. Рестриктазы различаются по чувствительности к такому типу модификации субстрата. Защита ДНК от действия некоторых рестриктаз может происходить вследствии метилирования только определенного нуклеотида в узнаваемой последовательности. Например, BamH I расщепляет последовательности 5'GGATCmC [238, 274] и 5'GGmATCC [98, 125], но не действует на 5'GGATmCC [169]. Последний вариант метилирования узнаваемого участка соответствует каноническому. В отличие от приведенного примера существуют также рестриктазы, ингиби-руемые метилированием нескольких различных оснований в узнаваемой последовательности нуклеотидов. Например, рестриктазы Xho I и SalG I, узнающие последовательности 5'CTCGAG [145] и 5'GTCGAC [66] соответственно, не расщепляют субстрат, содержащий в вышеуказанных последовательностях метилированный аденин или внутренний цитозин [129, 254]. Обсуждая влияние сайт-специфического метилирования в неканонических положениях узнаваемого участка следует иметь ввиду, что ингибирующее действие на рестриктазы не всегда проявляется по принципу «да» или «нет» [105, 258]. Иногда наблюдается только снижение активности фермента в 5—20 раз [152, 274]. В таких случаях конечный результат может зависеть от условий проведения реакции, времени ее протекания, концентрации фермента. Возможно этим следует объяснить, например, противоречивые данные о том, что RXma I расщепляла 5'CCm5CGGG последовательность в эукариотической ДНК, но не в ДНК Н. parainfluenzae [98, 415, 416]. 4.4.2. Чувствительность рестриктаз к природе минорного основания До недавнего времени специфичность рестриктаз к модификации субстрата изучалась только в отношении местоположения модифицированного основания в узнаваемой последовательности нуклеотидов. Открытие Ы4-метилцитозина (т4С) [56, 103, 191] поставило вопрос о способности рестриктаз дифференцировать два по разному модифицированные цитозина (N4- и 5-метилцитозин), локализованные в идентичных местах узнаваемой последовательности нуклеотидов. Такие исследования впервые были проведены на примере рестриктаз Mva I и EcoR II, узнающих 5'CC(A/T)GG последовательность. Метилирование внутреннего цитозина в указанном участке по 5-тому положению (образуется 5-метилцитозин) защитило субстрат от действия EcoR II, но не от Mva I [103]. В случае появления в этом же месте №-метилцитозина ДНК становилась устойчивой кдей- 48 ствию обеих исследуемых рестриктаз. Сказанное иллюстрируется схемой, которая приводится ниже. (перечеркнутой стрелкой обозначено отсутствие действия фермента) . Оказалось, что аналогичным свойством в отношении некоторых положений участка узнавания обладают также рестриктазы Xma I, Cfr9 I, Sma I, Нра II [105], Ben [191] и предположительно BstN I [258]. Эти данные указывают на больший блокирующий эффект т4С по сравнению с т5С, так как известна лишь одна рестриктаза, способная расщеплять сайт при наличии m4C — Msp I [105]. Целая группа ферментов блокируется при наличии метилированных цитозинов любой природы в идентичных положениях узнаваемого участка [102, 103, 105]. Таким образом эти ферменты оказались неспособными дифференцировать ш5С и т4С. Выше были рассмотрены общие вопросы, касающиеся проявлений специфичности рестриктаз по отношению к природным модификациям субстрата. Ниже излагаются сводные данные и некоторые следующие из них частные обобщения. 4.4.3. Сводные данные о чувствительности рестриктаз к модификациям субстрата Чувствительность рестриктаз к различным модификациям субстрата представляет собой важное проявление их специфичности. Поэтому такие данные регулярно обобщаются и публикуются. Выполняется эта работа в основном Макклелландом [252, 253, 258]. В табл. 12 представлены сводные данные, касающиеся характеристики ферментов рестрикции II типа [258]. Они обобщают совокупность известных данных о чувствительности рестриктаз к метилированию субстрата. Ниже приводятся некоторые частные обобщения, составленные на основе данных, приведенных в табл. 12. RMval REcoRE RMva I 4-5933 49 Таблица 12 Чувствительность эндонуклеаз рестрикции к метилированию субстрата Рестриктаза Узнаваемая последовательность Расщепляемые последовательности Нерасщепляемые последовательности AacI CCWGG C°5CWGG ? Aatl AGGCCT ? AGGm5CCT AGGCm5CT AccI GTMKAC ? GTMKm6AC* GTMKAm5C AccII CGCG ? m5CGCG АссШ TCCGGA Tm6CCGGA TCCGGm6A TCm5CGGA АШ GGWCC GGWCm5C ? Aha 11 GRCGYC6 ? GRm5CGYC GRCGY^C AIuI AGC Г ? »6AGCT AGm4CT AGffl5cr+ AGhm5CT Alwl GGATC ? GGm6ATC GGATm4C Amal TCGCGA TCGCGm6A ? AosII GRCGYC ? GRm5CGYC Apal GGGCCC ? GGGm5CCC# GGGCCm5C ApaLI GTGCAC GTGCm6AC Apyl CCWGG Cm5CWGG5 m5CCWGG AquI CYCGRG ? »5CYCGRG* Asp718I GGTACC GGTmeACC6 GGTACm5C GGTAm5Cm5C6 AsuII TTCGAA TTm5CGAA ¦> AtuCl TGATCA TGm6ATCA Aval CYCGRG Cm5CCGGG m5CYCGRG CYm5CGRG CTCGm6AG6 Avail GGWCC ? GGWm5CC GGWCm5C GGWhm5Chm5C Ball TGGCCA ? rGGm5CCA* TGGC-^CA6 BamHl GGATCC GGATCm5C GGATm4CC* GGm6ATCC GGATm5CC GG»6ATCm5C GGAThm5Chm5C BamFI GGATCC GGm6ATCC ? BamKI GGATCC GGm6ATCC ? Banl GGYRCC6 GGm5CGCC ? Banll GRGCYC ? GRGm5CYC Banlll ATCGAT ? ATCGm6AT Bbvl GCWGC ? Gm5CWGC* Bell TGATCA6 TGATm5CA TGm6ATCA TGAThm5CA Ben! CCSGG m5CCSGG Cm4CSGG* BepI CGCG ? m5CGCG Bgll GCCN5GGC GCm5CN5GGC Gm5CCN5GGC. 50 Продолжение таблицы 12 Рестриктаза Узнаваемая Расщепляемые Hep зацепляемые последовательность последовательности последовательности GCCN5GGm5C6 BglH AGATCT6 AGm6ATCT AGATm5CT AGAThm5CT BinI GGATC ? GGm6ArC Bme216I GGWCC ? GGWCm5C Bsp 12861 GDGCHC ? GDGm5CHC BspHI TCATGA ¦> TCATGm6A BspMI ACCTGC ? ACCTG»5C BspMII TCCGGA TCCGGm6A Tm5CCGGA ТСш5ССОА BspNI CCWGG ffl5CCWGG ? Cm5CWGG BstYI RGATCY RGm6ATCY RGATm4CY BspXI ATCGAT ? ATCGm6AT BspXII TGATCA ? TGm6ATCA BssHII GCGCGC6 ? Gm5CGm5CGC BstI GGATGC GGm6ATCC GGATm*CC GGATCm5C GGATm5CC BstBI TTCGAA ? TTCGmeAA BstEII GGTNACC GGTNAm5Cm5C6 GGTNAhm5Chm5C BstEII I GATC6 ? Gm6ATC BstGI TGATCA ? TGm5ATCA BstNI CCWGG6 m5CCWGG6 hm5Chm5CWGG Cm5CWGG mSCm5CWGQ6 BstUI CGCG ? m5CGm5CG BstXI |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 |
Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |