Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

, метилирование которых препятствует действию данной рестриктазы, выделены полужирным шрифтом. В настоящее время для ряда рестриктаз, участки узнавания которых полностью или частично перекрываются с dcm и dam сайтами, определено влияние обсуждаемого метилирования на их способность расщеплять субстрат. Эти данные представлены в. табл. 16 и 17.

60

Таблица 16

Чувствительность рестриктаз к dcm метилированию

Рестриктазы, чувствительные к Рестриктазы, не чувствительные dcm метилированию к dcm метилированию Название фермента Специфичность3 Название фермента Специфичность3

(изошизомеры)® (изошизомер ы)® Ava II (Bme216 I, GGWCC BamH I (Bst I) GGATCC

Есо47 I) Afl I GGWCC

Ара I GGGCCC Bgl I GCCN5GGCT

Asp718 I GGTACC BstE II GGTNACC

Dra II RGGNCCY BstN I (Aac I, CCWGG

(ЕсоОЮЭ I) Ару I, BspN I,

Eae I YGGCCR Mva I, TaqX I)

EcoR II (Mph I) CCWGG CviNY I CC

Sau 96 I GGNCC Fok I CATCC

ScrF I (Sso II) CCNGG Hae III GGCC

Stu I (Aat I) AGGCCT Kpn I GGTACC

Nar I GGCGCC

Sfi I GGCCN5GGCC

a—см. пункт «а» примечаний к табл. 12. б — в скобках приведены названия изошнзомеров аналогично реагирующих на dcm метилирование.

Таблица 17

Чувствительность рестриктаз к dam метилированию

Рестриктазы, чувствительные к Рестриктазы, не чувствительные к dam метилированию к dam метилированию Название фермента (изошизомеры )® Специфичность2 Название фермента (изошизомеры)® Специфичность3

Bel I (AtuC I, TGATCA BamH I (BamF I, GGATCC

BspX II, BstG I, BamK I, Bst I)

Cpe I) Bgl II (Ncr I) AGATCT

Cla I (Ban III, ATCGAT BspM II (Mro I) TCCGGA

BspX I) Pvu I (Rsh I, CGATCG

Hph 1 GGTGA Xor I)

Mbo I (BstE II, GATC Sau3A I (FnuE I, GATC

CviA I, Dpn II, Pfa I, Dpn I*, Cfu I*, Nan II*,

Mme II, Nde II)

Mbo II (Ncu I) GAAGA NmuD I*, NmuE I*)

Nru I (Ama I) TCGCGA Spo I TCGCGA

Taq I (Tfl I, TCGA Xho I (BstYI) RGATCY

TthHB I)

Xba I TCTAGA

Acc III TCCGGA

Bin I (Alw I) GGATC

Bsph I TCATGA

Mfl I RGATCY

a — см. пункт «а» примечаний к табл. 12. б — в скобках приведены названия нзошизомеров, аналогично реагирующих на dam метилирование.

* — расщепляет только при наличии ш6 в обеих цепях узнаваемой последовательности.

61

4.4.7. Чувствительность метилаз к модификациям субстрата

Чувствительностью к сайт-специфическому метилированию отличаются не только рестриктазы, но и другие белки, взаимодействующие с ДНК [357, 387]. Метилазы не являются в этом отношении исключением. Сайт-специфические модификации типа т5С, т6А, т4С и hm5C (5-гидроксиметилцитозин) в неканонических положениях иногда ингибирует действие некоторых метилаз. Сводные данные представлены в табл. 18.

Таблица 18

Чувствительность метилаз к модификациям субстрата

Метилаза (специфичность)3 He блокируется предвари- Блокируется предвари-

тельной модификацией тельной модификацией

MAlu I (AGm5CT) AGm4CT

MBamH I (GGATm4CC) GGm6ATCC GGATCm5C

MBst I (GGATmCC) GGm6ATCC

MCfr6 I (CAGm4CTG) CAGm5CTG

MCla I (ATCGm6AT) m6ATCGAT ATm5CGAT

MCviB III (TCGm6A) Tm5CGA

MEcoR I (GAm6ATTC) GAATTm5C Gm6AATTC

MEcoR II (Cm5CWGG) Cm4CWGG

MEco dam (Gm6ATC) GATm5C

GAThm5C GATm4C

MFok IA (GGm6ATG) CATCm5C CATm5CC

MHha I (Gm5CGC) GCG^C

MHha II (Gm6ANTC) GANTm5C

МНра II (C^CGC) m5CCGG

MHph I (Tm5CACC) GGTGm6A

MMbo I (Gm6ATC) GATm5C

MMbo II (GAAGm6A) Tm5CTTm5C

MMsp I (m5CCGG) Cm5CGG

MMva I (Cm4CWGG) Cm5CWGG

MPvu II (CAGm4CTG) CAGm5CTG

MEcoT2 dam (Gm6ATY) GAThm5C

MEcoT4 dam (Gm6ATC) GAThm5C

MTaq I (TCGm6A) Tm5CGA

a — см пункт «а» примечаний к табл. 12., б — см. пункт «б» примечаний к табл. 13.

Интересно отметить, что имеется пример отсутствия ингиби-ции реакции метилирования даже в случае действия на субстрат метилаз, узнающих одинаковые последовательности нуклеотидов, и модифицирующих одно и то же основание в разных метах. Речь идет о MEcoR II и MMva I, которые узнают последовательность 5'CC(A/T)GG и модифицируют цитозин, расположенный рядом с осью симметрии, образуя ш5С и ш4С соответ-

62

ственно. Последовательная обработка in vitro субстрата MEcoR II и MMva I приводит к образованию №,5-диметилци-тозина [103]. Таким образом MMva I оказалась нечувствительной к метилированию цитозинового остатка по 5-тому положению. Модификация по ^-положению, наоборот ингибирует MEcoR II. В другом аналогичном исследованном случае, касающемся ферментов MAlu I, MPvu II (и ее изаметимера MCfr6 I), узнающих соответственно 5'AGCT (образуется т5С) и 5'CAGCTG (образуется ш4С) имела место ингибиция последующего альтернативного метилирования по этому же цитозиново-му остатку [102].

Как следует из данных представленных в табл 18, аналогично реагирует на модификацию субстрата MBamH I.

4.5. Практическое применение сведений о различных проявлениях субстратной специфичности рестриктаз

Сведения о различных проявлениях субстратной специфичности рестриктаз, наряду с их теоретической значимостью, имеют большое практическое значение — являются предпосылкой для целенаправленного использования этих ферментов в различных отраслях их применения в качестве аналитических реагентов. В первую очередь это замечание относится к изучению специфики метилирования эукариотической ДНК- В этой ДНК в качестве минорного основания присутствует 5-метилцитозин [46, 129]. Подавляющее его большинство содержится в составе CG-динуклеотида [46, 129]. Именно использование рестриктаз, чувствительных к метилированию цитозина, впервые открыло возможность изучать вышеуказанный вопрос [124, 129, 379, 416].

Интересным практическим приложением чувствительности рестриктаз к метилированию является создание при его помощи новых вариантов фрагментирования субстрата [274]. Этот метод заключается в модификации ДНК сайт-специфической метилазой, узнаваемый участок которой частично перекрывается с таковым рестриктазы, при помощи которой предполагается расщеплять субстрат. Таким приемом можно изменить частоту расщепления субстратной ДНК- Например, рестриктаза Nhe I способна расщеплять ДНК аденовируса-2 в четырех местах, содержащих последовательность 5'GCTAGC. Метилирование этой ДНК при помощи метилазы Alu I, модифицирующей цитозино-вый остаток в последовательности 5'AGmCT [25], в перекрывающихся участках (5'AGmCTAGC) делает устойчивой к действию Nhe I последовательность 5'GCTAGC [274]. Вследствие этого Nhe I расщепляет ДНК аденовируса-2 только в одном участке [274]. Таким образом in vitro можно достичь совершенно нового варианта фрагментирования ДНК, неосуществимого ни одной известной рестриктазой.

Набор имеющихся рестриктаз и метилаз в настоящее время позволяет получать десятки вариантов фрагментации ДНК [22, 274]. Особенно следует выделить работы, направленные

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.09.2019)