Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

еотидных последовательностей, окружающих различные участки узнавания, с ферментом в переходном состоянии реакции. Это предположение было частично подтверждено тем, что, как было установлено [160], константы связывания EcoR I с различными участками ДНК были одинаковыми.

Исследование кинетики расщепления линейных молекул ДНК, содержащих уникальный сайт узнавания рестриктазы EcoR I, показало [186], что скорость реакции гидролиза зависит от длины ДНК. Так, скорость расщепления рестриктазой EcoR I ДНК длиной 1361 нп в 9 раз превышала скорость гидролиза фрагмента ДНК длиной 34 нп. Эти экспериментальные результаты позволили авторам [186] выдвинуть предположение, что процесс локализации специфической нуклеотидной последовательности, расположенной на линейной молекуле ДНК происходит не в результате случайных столкновений фермента с ДНК, а путем его одномерной диффузии вдоль молекулы ДНК, т. е. рестриктаза на первой стадии, по-видимому, связывается с неспецифической нуклеотидной последовательностью, а локализация специфической последовательности происходит в результате одномерной диффузии. Также показано [368], что после расщепления сайта узнавания рестриктазой EcoR I, фермент может передвигаться по ДНК в результате одномерной диффузии до следующего сайта, что может приводить к процессивному распределению узнаваемых участков, если они

75

расположены на определенном расстоянии. Следует отметить, что имеются экспериментальные данные [162], свидетельствующие об отсутствии влияния одномерной диффузии на скорость гидролиза ДНК фага X эндонуклеазной рестрикции EcoR I. Эти кажущиеся различия также могут быть объяснены относительно высокой ионной силой (порядка 100 мМ NaCl), использованной в последнем случае, так как имеются данные, что при увеличении концентрации NaCl в реакционной смеси до 150 мМ, различий в скорости гидролиза двух рядом расположенных EcoR I сайтов практически не наблюдалось [162].

Интересные результаты в отношении гидролиза длинных линейных молекул ДНК рестриктазои EcoR II были получены Крюгером с сотр. [213]. Ими установлено, что ДНК фагов ТЗ и Т7, содержащие немодифицированные участки узнавания REcoR II, не расщепляются этим ферментом. Однако добавление в реакционную среду ДНК, содержащей легко расщепляемые сайты EcoR II, приводило к гидролизу и резистентных сайтов ДНК фагов ТЗ и T7 ферментом. Молекулярный механизм этого эффекта пока не установлен, но, по-видимому, может быть связан с аллостерической активацией рестриктазы EcoR II.

6.1.4. Гидролиз синтетических олигонуклеотидов эндонуклеазами рестрикции

Развитие методов синтеза олигонуклеотидов открывает широкие возможности для исследования механизмов взаимодействия ДНК с эндонуклеазами рестрикции. Так, еще в 1975 году было показано [149], что рестриктаза EcoR I расщепляет синтетический комплементарный олигонуклеотид 5'-TGAATTCA. Исследование кинетики гидролиза этого дуплекса показало, что каталитическая константа его гидролиза составляет 4 мин-1 [149] и практически не отличается от аналогичной константы гидролиза ДНК вируса SV 40 [149]. Однако, большие различия были обнаружены при сравнении констант Михаэлиса. Км реакции EcoR I с ДНК вируса SV 40 составляла 3X10-8 М и была примерно в 200 раз ниже аналогичной константы в случае использования в качестве субстрата синтетического олигонуклеотида. Более детально кинетика гидролиза олигонуклеотидов была исследована в случае эндонуклеазы Sea I [208]. При исследовании скорости гидролиза синтетических олигонуклеотидов, представляющих окта-, дека-, додека-и гексадекаолигонуклеотидные дуплексы, содержащие участки узнаваемые обсуждаемым ферментом, было установлено, что максимальная скорость гидролиза этих субстратов практически не отличалась от Vm гидролиза линеаризованной формы плаз-

76

миды pBR322, содержащей уникальный участок узнавания Sea I, однако наблюдались довольно большие различия для констант Михаэлиса.

6.1.5. Расщепление однонитевдй ДНК эндонуклеазами рестрикции

Все ранее изложенные экспериментальные результаты, касались гидролиза двухспиральных ДНК. Однако, в середине 70-х годов появились сообщения [85, 86], что некоторые рестриктазы (Hae III, Sfa I и Hha I) специфически расщепляют однонитевую ДНК бактериофагов М13 и ФХ174. С целью объяснения этих экспериментальных результатов, авторы [85] предположили, что вирусная ДНК находится в конформации, в которой ее нити частично перекрываются, образуя дуплексы как раз в районе участка расщепляемого этими ферментами.

Рассмотренные выше работы проводились с применением в качестве субстратов одноцепочечных ДНК из природных источников, что не исключает возможности существования дуплексных структур, образующихся в результате конформацион-ной подвижности ДНК. Использование с этой целью олиго-нуклеотидных субстратов определенной структуры, позволяет исключить возможность образования внутримолекулярных дуплексов. Например, для рестриктазы Msp I синтезирован субстрат 5'-GAACCGGAGA, где появлению упомянутого дуплекса препятствует не только пространственное расположение фланкирующих пуриновых оснований, но и их природа, дестабилизирующая любое спаривание оснований в сайте узнавания [411]. Тем не менее этот олигонуклеотид расщепляется исследуемым ферментом. В аналогичных экспериментах было показано, что рестриктаза Mno I [73], как и большинство рестриктаз, ргсщепляет только двухспиральные субстраты, а EcoR II [407, 410] и EcoR I [84, 114] гидролизуют как одноните-вые, так и двухцепочечные фрагменты ДНК. Для рестриктазы Нра II существуют противоречивые данные. Одни авторы считают [73], что она гидролизует только двухпиральные фрагменты ДНК, а другие [411] высказывают предположения о расщеплении ею однонитевого субстрата.

Следует отметить, что расщепление однонитевого субстрата проходит значительно медленнее (в 10—30 раз), чем ДНК-дуплекса, к тому же требуется увеличение концентраций фермента и субстрата [411].

Исследование проблемы гидролиза однонитевой ДНК с использованием олигонуклеотидных субстратов не способных образовывать дуплексную структуру в растворе в отсутствии рестриктазы, не исключает возможности ее формирования в результате взаимодействия двух фермент-субстратных комплексов [411].

77

7. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РЕСТРИКТАЗ II ТИПА С МОДИФИЦИРОВАННЫМИ СУБСТРАТАМИ

Нуклеиновые кислоты — полифункциональные соединения, содержащие большое число реакционоспособных групп, которые могут модифицироваться под действием различных химических реагентов. Модификациям подвержены все компоненты— гетероциклические основания, углеводные остатки, а также остатки фосфорной кислоты. Направленные модификации различных функциональных групп ДНК широко применяются при исследовании первичной и пространственной структуры, а также для изучения взаимодействия ферментов и других белков с ДНК.

При полноценном взаимодействии фермента с узнаваемой последовательностью образуются определенные связи: водородные [90], гидрофобные, «стэкинг» и ионное взаимодействие. Важную роль играют стерические факторы и, конечно, конформация ДНК [1

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.09.2019)